專利名稱：一種復合鴨α干擾素基因、其重組載體及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種復合鴨α干擾素基因、其重組載體及其在生產(chǎn)鴨α干擾素中的應用。
背景技術(shù)：
干擾素(interferon, IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白),是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。干擾素是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙 肝病毒的復制；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能力。干擾素是動物機體最重要細胞因子之一，具有廣譜、高效的抗病毒功能，對免疫系統(tǒng)起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。干擾素是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復制；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能力。干擾素的作用具有物種局限性，不同物種的干擾素可能會有一定的交叉作用，如人干擾素在犬類應用也有一定效果，然而研究表明，大多數(shù)干擾素不能跨物種使用，干擾素用在本種動物才能發(fā)揮較好的抗病毒和免疫調(diào)控效果。九十年代,美國安進公司研究出一種全新的人復合alpha干擾素Infergen。這種復合干擾素是一種非自然的干擾素，166aa序列的獲得是通過對幾種天然alpha亞型干擾素序列的掃描，把最常見的氨基酸轉(zhuǎn)移到各個相應的位置。為便于分子構(gòu)造，還另改變了 4個氨基酸。Infergen序列與alpha II型干擾素的同源性為88%,與beta干擾素的同源性為30%，且相似性較任何天然的α干擾素要高。實驗證明=Infergen的抗多種病毒的活性較天然的干擾素高5倍，按WHO人源干擾素抗病毒策略為標準得到其抗病毒活性為I X IO9U/
mg ο近年來，雞干擾素(ChIFN)的研究與應用十分引人注目，尤其是其重組干擾素-α(rChIFN- α )在改善和治療A類傳染病(新城疫和禽流感)，以及傳染性法氏囊炎(IBD)和傳染性支氣管炎(IB)等病毒性疾病方面效果顯著，展示出了禽類干擾素的應用前景。禽類干擾素用于禽類疾病防制，可直接注射，也可通過飲水給藥。Marcu等采用飲水給藥的方法進行了重組ChIFN-α抗新城疫病毒的研究，雛雞I日齡起每天給予不同濃度的重組ChIFN- α (10、100、500、1 000,2 000 IU/mL)飲水，在2日齡時進行新城疫病毒La Sota株的攻毒試驗(點眼O. 5 mL (5 10)X 105 EID50/只)，研究表明高劑量的重組ChIFN-α可以延遲病癥的出現(xiàn)并且顯著降低試驗雞的發(fā)病程度。在試驗中，對照組雞只在7日齡出現(xiàn)致死性癥狀及組織學病變，而飲用高劑量(I 000,2 000 IU/mL)重組ChIFN-α的雞只則在整個試驗期間(12 d)精神狀態(tài)良好，與未攻毒的雛雞相比，無大體病變及組織學病變出現(xiàn)，500 IU/mL的重組ChIFN-α足以緩和新城疫引起的病理變化。
與雞相比，鴨干擾素方面的研究相對較少。1995年，Schultz等以ChIFN-α基因為探針，從綠頭野鴨的基因組中克隆了鴨α-干擾素基因(DuIFN-a)，并在pET28A-E. coli和pcDNAI- C0S7表達系中進行了有效表達。Schult z等發(fā)現(xiàn)重組鴨干擾素-a (rDuIFN -a)能抑制VSV、NDV和A型流感病毒(Flu- A)的增殖，并建立了鴨病毒性肝炎(DHBV)-干擾素實驗系用于人類病毒性肝炎的模型研究[2]。2004年，阮小飛[3]等從北京鴨(A nas p latyr hy nchos d oestica L innaeus)基因組中克隆了其干擾素-α基因克隆片段長486 bp，編碼161個氨基酸的成熟肽。將該基因插入原核表達載體PQE30，在E. coli JM109工程菌中進行表達，重組蛋白以包涵體形式存在于E. coli. JM109工程菌中，在經(jīng)過SM尿素變性、透析、復性后成為了具有抗病毒活性的重組鴨干擾素，抗水皰性口炎病毒(VSV)活性高達7. 9 X IO5IU/ mg。陳斌M等克隆了北京麻鴨生物信息學分析表明，麻鴨α -干擾素的開放性閱讀框有576個核苷酸組成，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為21kD，編碼191個氨基酸，其中前28個氨基·酸可能是信號肽部分，切割位點在28號氨基酸和29號氨基酸之間，基因序列中無內(nèi)含子。繼而陳斌將麻鴨α-干擾素插入質(zhì)粒PCDNA3. 1，將獲得的重組質(zhì)粒作為免疫調(diào)節(jié)劑研究對DPV/DVH弱毒苗免疫活性調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，含有麻鴨α _干擾素基因的重組表達質(zhì)粒在鴨體內(nèi)具有表達活性，并在一定時間內(nèi)能促進和提高免疫和體液免疫應答，發(fā)揮著有效的正向免疫調(diào)節(jié)作用。以往干擾素的制備方法主要有兩種由誘生劑誘導動物細胞產(chǎn)生、原核表達。由誘生劑誘導產(chǎn)生鴨IFN-α，產(chǎn)生的干擾素產(chǎn)量少、成本高、純化工藝復雜，因而價格昂貴，極大程度上限制了臨床和科研的應用。原核表達系統(tǒng)中其產(chǎn)物主要以無生物活性的包涵體形式存在，若要想獲得具有生物活性的重組蛋白必須對包涵體進行變性、復性等繁瑣的后續(xù)處理工作，而后續(xù)處理工作中重組蛋白的損失量大而且對工作人員的技術(shù)水平要求也很高，這不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種復合鴨α干擾素基因。本發(fā)明的另一個目的在于提供含有復合鴨α干擾素基因的克隆載體。本發(fā)明的另一個目的在于提供含有復合鴨α干擾素基因的表達載體。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種鴨α干擾素的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種復合鴨α干擾素基因，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，或是SEQ ID Ν0:1所示的序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸和/或末端修飾后具有同等活性的序列。一種克隆載體，含有上述的復合鴨α干擾素基因。—種表達載體，含有上述的復合鴨α干擾素基因。其出發(fā)載體為酵母表達載體pPICZ a A、pPICZ a B 或 pPICZ α C。一種鴨α干擾素的生產(chǎn)方法，包括將上述的表達載體導入宿主細胞中，表達得到鴨α干擾素。所述宿主細胞為畢赤酵母X-33、GS115、KM71或SMD1168。
由以上方法生產(chǎn)得到的鴨α干擾素。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明經(jīng)優(yōu)化后的復合鴨α干擾素基因可在畢赤氏酵母基因工程菌中表達生產(chǎn)復合鴨α干擾素。該方法得到的復合鴨α干擾素與天然鴨α干擾素和用大腸桿菌表達的天然鴨α干擾素相比具有下幾個優(yōu)點
(1)本發(fā)明的復合鴨α干擾素表達量大、純度高酵母表達的鴨α干擾素SDS-PAGE結(jié)果經(jīng)薄層掃描顯示，重組酵母鴨α干擾素的目的條帶占總表達蛋白量的80%以上；
(2)抗病毒作用強該新型基因組表達的蛋白與酵母表達的天然鴨α干擾素相比，有更好的抗病毒活性，其在鴨胚成纖維細胞上抵抗Iootcid5ciVSV病毒感染的作用提高了 40倍；
(3)無毒害物質(zhì)酵母不會分泌像大腸桿菌表達的外源蛋白那樣附帶一些對鴨體細胞·有毒害的毒素。說明書附圖

圖I質(zhì)粒pPICZ a-MDuIFNa質(zhì)粒圖譜；
圖2重組表達載體pPICZ a-MDuIFNa的EcoRI和XbaI雙酶切鑒定(Μ· DL5000marker ；1. pPICZ a -MDuIFNa 的 EcoRI 和 XbaI 雙酶切產(chǎn)物)；
圖 3 重組畢赤酵母 X-33/pPICZ a-MDuIFNa 的 PCR 鑒定(I. DL5000marker ；2-5.X-33/pPICZa -MDuIFNa ；C.菌株 X33 作為陰性對照)；
圖 4 復合鴨 a 干擾素的誘導表達的 SDS-PAGE(M. marker ；1. X-33/pPICZ a -MDuIFN α誘導表達上清；C. Χ33培養(yǎng)上清作為陰性對照)；
圖5復合鴨α干擾素和天然鴨α干擾素的誘導表達的SDS-PAGE (Μ. marker ；1.天然鴨α干擾素誘導表達上清；2. X-33/pPICZ-MDuIFN α復合鴨α干擾素誘導表達上清)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術(shù)包括PCR擴增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京科學出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例I 材料
I.I復合鴨α干擾素基因
根據(jù)Genbank中的鴨α干擾素成熟蛋白的編碼基因(Genbank登錄號EF053034)，對其進行DNA核苷酸序列密碼子優(yōu)化設計，得到復合α鴨干擾素基因序列，如SEQ ID NO: I所示。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。I. 2菌種、細胞和病毒
巴斯德畢赤酵母(/7ZcAia pas tor is X33)、酵母表達載體pPICZ a A購自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5a株本實驗室保存；水皰性口炎病毒(VSV病毒)由本實驗室保存。
I. 3 試劑
質(zhì)粒小量提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒、T4連接酶等試劑均購自TaKaRa公司。2方法與結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種復合鴨α干擾素基因，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，或是SEQ ID NO 1所示的序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸和/或末端修飾后具有同等活性的序列。
2.一種克隆載體，含有權(quán)利要求I所示的基因。
3.—種表達載體,含有權(quán)利要求I所不的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于，出發(fā)載體為酵母表達載體pPICZa A、pPICZaB 或 pPICZaC。
5.—種鴨a干擾素的生產(chǎn)方法,包括將權(quán)利要求3或4所述的表達載體導入宿主細胞中，表達得到鴨a干擾素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鴨a-干擾素的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述宿主細胞為畢赤酵母 X-33、GS115、KM71 或 SMDl 168
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法生產(chǎn)得到的鴨a干擾素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復合鴨α干擾素基因、其重組載體及應用。所述復合鴨α干擾素基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明經(jīng)優(yōu)化后的復合鴨α干擾素基因可在畢赤氏酵母基因工程菌中表達生產(chǎn)復合鴨α干擾素，所得到的復合鴨α干擾素純度高酵母表達的鴨α干擾素SDS-PAGE結(jié)果經(jīng)薄層掃描顯示，重組酵母鴨α干擾素的目的條帶占總表達蛋白量的80%以上；抗病毒作用強該新型基因組表達的蛋白與酵母表達的天然鴨α干擾素相比，有更好的抗病毒活性，其在鴨胚成纖維細胞上抵抗100TCID50VSV病毒感染的作用提高了40倍?？捎糜谥苽渲委熐蓊惒《拘约膊〉乃幬铩?br> 文檔編號C12N15/21GK102899331SQ201210362429
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者向華, 黃元, 王曉虎, 陳晶, 張健騑 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所