專利名稱：一組特異識別黃曲霉毒素B₁的寡核苷酸適配子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及到利用分子生物學技術中的SELEX技術(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術)制備一組與黃曲霉毒素B1高特異性和高親和力的核酸適配予，為該核酸適配子在檢測黃曲霉毒素B1中的應用提供科學依據(jù)和理論基礎。
背景技術：
黃曲霉毒素(aflatoxins，AF)主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代謝產(chǎn)物，其化學結(jié)構(gòu)類似，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。目前已確 定黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)的有AFBpAFB2、AFM1等18種，它們的基本結(jié)構(gòu)中都含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰酮(又名香豆素)，前者為其毒性結(jié)構(gòu)，后者可能與其致癌有關。黃曲霉毒素耐高溫，通常加熱處理對其破壞很小，只有在熔點溫度下才發(fā)生分解。黃曲霉毒素遇堿能迅速分解，但此反應可逆，即在酸性條件下又復原。在溫暖潮濕氣候地區(qū)的糧食和飼料，凡被黃曲霉菌和寄生曲霉菌污染都可能存在黃曲霉毒素。黃曲霉毒素最易污染花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麥、高粱和甘薯，大豆柏被黃曲霉毒素污染的程度輕些。我國糧食和飼料被黃曲毒素污染率很高，給飼料企業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)主帶來了很大損失。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)劃定為I類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡，在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強，其致癌力是奶油黃的900倍，比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍，比3，4_苯并芘大4000倍。它主要誘使動物發(fā)生肝癌，也能誘發(fā)胃癌、腎癌、直腸癌及乳腺、卵巢、小腸等部位的癌癥；其毒性遠遠高于氰化物、砷化物和有機農(nóng)藥，比氰化鉀大100倍，比砒霜大68倍。因此，如何快速、準確檢測出黃曲霉毒素B1具有重要研究意義。目前，對真菌毒素B1的檢測方法應用最多的是抗原抗體法即免疫學方法，但這種方法需要制備特異性的抗體，抗體具有不穩(wěn)定性，制備的成本較高而且不宜保存，受免疫原性等的限制。這些不足制約了免疫學方法在真菌毒素領域中的應用。而且目前存在的檢測方法檢測限普遍較高，不適合真菌毒素中毒具有隱蔽性和微量性的特點。因此，建立新的對真菌毒素尤其是黃曲霉毒素B1為典型代表的快速而靈敏的檢測方法尤為必要。近些年來，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注目。寡核苷酸適配子是通過SELEX過程篩選的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術)是20世紀90年代初研制的一種新的組合化學技術，是一種研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的有效方法。其基本原理是體外化學合成一個隨機單鏈寡核苷酸庫，用它與靶物質(zhì)混合形成靶物質(zhì)-核酸復合物，洗去未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進行下輪的篩選過程。通過數(shù)輪重復篩選與擴增，最后得到高親和力和高特異性的寡核苷酸適配子即Aptamer。利用SELEX技術篩選獲得的Aptamer識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，適配子具有更明顯的優(yōu)越性，如不依賴動物細胞，不受免疫條件和免疫原性限制，適配子的篩選完全在體外進行，具有時間、質(zhì)量和數(shù)量上的選擇彈性，可以在合成時精確、定點、隨意連接其他功能基團和分子；適配子變性與復性可逆且速度快，可反復使用、長期保存和室溫運輸；靶分子范圍更廣，除蛋白質(zhì)、核苷酸大分子外，還有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶堿等)、生長因子、肽鏈、類固醇、糖類、輔因子(如FMN等)，甚至可用于完整的細胞、病毒、孢子等；與靶分子結(jié)合具有更強的特異性和親和力，不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾，可以在靶目標性質(zhì)未知的情況下篩選出其相應的適配子；適配子通過占據(jù)靶物質(zhì)表位，使疾病得到控制，作為臨床藥物的治療，已顯現(xiàn)了潛在的應用前景，已有研究通過SELEX技術篩選到相應靶物質(zhì)的適配子作為拮抗劑，抑制腫瘤生長時的血管內(nèi)皮生長因子、血栓生成因子、ー些毒素蛋白等的作用，以達到治療目的。在微生物檢測方面，特別是對ー些致病性細菌或病毒的研究，雖然不知道其內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能及這些物質(zhì)的表位，但將其作為靶物質(zhì)，通過SELEX過程篩選到與其對應的適配子，檢測靶物質(zhì)，已成為該領域的研究探索熱點。鑒于SELEX技術相對于傳統(tǒng)抗原抗體技術的優(yōu)勢，具有更高的選擇性，特異性和親和性，以及能區(qū)分結(jié)構(gòu)極其相似的物質(zhì)的特性，而且目前SELEX技術主要應用在整體菌 及細胞等大分子的篩選中，在小分子領域尤其是真菌毒素的應用中很少，據(jù)報道篩選出的真菌毒素適配體只有赭曲霉毒素和伏馬菌素的適配子，若能篩選出黃曲霉毒素B1的適配子對真菌毒素的檢測將有重要的意義，同時也將推動SELEX技術在小分子領域的發(fā)展，也是SELEX技術自身的完善。本發(fā)明以食品和糧食中常見的黃曲霉毒素B1為靶標，利用SELEX技術獲得了與黃曲霉毒素B1特異性結(jié)合的核酸適配子序列，該序列可以快速、準確檢測黃曲霉毒素B1，由于單鏈DNA寡核苷酸適配子性能穩(wěn)定、合成方便且廉價、經(jīng)修飾后可直接用于熒光或化學發(fā)光、發(fā)色方法檢測黃曲霉毒素B1，因此操作簡單、直接。該發(fā)明可以在食品安全檢測、臨床醫(yī)學等領域得到廣泛應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供ー種真菌毒素檢測方法，特別涉及ー種利用適配子技術快速、準確檢測黃曲霉毒素B1的方法。本發(fā)明方法利用指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化技術(SELEX技術)，以黃曲霉毒素B1為靶標，篩選獲得與靶標高親和性特異結(jié)合的適配子，通過羧基熒光素(FAM)標記方法達到快速、準確診斷食品或糧食中黃曲霉毒素B1的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(I)與蛋白類的抗體相比，單鏈寡核苷酸更為穩(wěn)定；Aptamer可直接體外合成、標記，不需要標記的ニ抗，使得操作更為簡單、迅速;Aptamer的合成成本較抗體制備成本低，周期短。(2)該序列是從結(jié)構(gòu)顯著、與靶標具有不同親和カ的9條適配子序列中選取出的親和カ和特異性均最強的一組適配子序列，能夠特異識別黃曲霉毒素


圖I是第ト10輪篩選得到的AFbi-SSDNA變性聚丙烯酰胺電泳圖
圖2是AFBfaptamer飽和結(jié)合曲線3是AFBfaptamer特異性圖表I代表適配子與AFBi的解離常數(shù)
具體實施例方式下面是通過SELEX技術篩選特異結(jié)合部分適配子與AFBl的解離常數(shù)的核酸適配子制備方法及其快速檢出部分適配子與AFB1的解離常數(shù)方面的應用。I、合成隨機單鏈DNA文庫和引物(IDT公司合成)隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫5’_AGCAGC ACA GAG GTC AGATG(N40)CCTATGCGT GCTACC GTG AA-3’，構(gòu)建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40·個堿基的隨機序列，庫容量為IO14以上；引物I :5’ -AGCAGCACAGAG GTCAGATG-3’ ；引物II 5’-P04-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3’，將隨機ssDNA文庫和兩種引物均用TE緩沖液配制成100 u mo I/L貯存液_20°C貯存?zhèn)溆谩?、雙鏈 DNA (dsDNA)及單鏈 DNA (ssDNA)文庫的 PCR 擴增取2mol隨機ssDNA文庫(第二輪開始每次加入200pmol)加入500 U L結(jié)合緩沖液 BB(pH7. 0 :100mmol/L NaCI,20mmol/L Tris-HCl pH7.6,2mmol/L MgCl2,5mmol/L KCl,lmmol/L CaCl2,0. 02% Tween20)，95°C水浴 5min，冰浴 5min 然后取 200 u L 連有目標物質(zhì)AFB1的磁珠，事先用BB沖洗，用磁鐵將其吸附在管子底部棄上清，然后將冰浴產(chǎn)物加入其中37°C搖床孵化2h。將孵化體系用混勻器震蕩20s，加磁鐵棄上清，反復用BB沖洗5次，每次lmL。在磁珠中加入洗脫緩沖液I XPCR擴增緩沖液100 u L，95°C水浴5min，冰浴5min，迅速震蕩20s加磁鐵將上清吸出即為洗脫液，再在磁珠中加入IOOii LI XPCR擴增緩沖液重復洗脫。將兩次洗脫液混勻作為模板PCR加樣模板5 u L，上下游引物各I U L，dNTPl u L，10XPCR擴增緩沖液5 ii L，滅菌水36. 5 ii L，Taq酶0. 5 ii L,總體積為50 y L在95°C 5min,95°C 30s, 60°C 40s, 72°C 30s，循環(huán) 30 次，72°C 7min, 12°C 2min 條件下擴增。將擴增產(chǎn)物用6 X DNA凝膠上樣緩沖液(溴酚藍0.25%，蔗糖40 %，水59. 75 % )跑變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，驗證擴增是否成功，然后在同樣條件下進行大批量擴增以備純化和單鏈制備，將酶切好的單鏈置4°C環(huán)境中儲存?zhèn)溆?，進行下ー輪的篩選。3、篩選所用黃曲霉毒素B1的獲取與處理黃曲霉毒素B1屬于小分子，要與SELEX技術結(jié)合必須借用一定的載體，首先選擇了氨基化的磁珠作為載體，然后對黃曲霉毒素B1進行了活化使其帶上羧基，采用EDC-NHS連接方法將黃曲霉毒素B1固定在磁珠的表面，表征活化連接成功后4°C環(huán)境中儲存?zhèn)溆谩?、克隆和測序?qū)⒌谑喐患膕sDNA文庫，PCR擴增為雙鏈，送上海生エ生物技術有限公司進行DNA序列測定，獲得30條適配子序列。5、適配子序列結(jié)構(gòu)分析采用DNAMAN軟件和RNA Structure4. 2軟件分別對適配子序列進行ー級結(jié)構(gòu)和ニ級結(jié)構(gòu)分析，獲得30條序列的同源性信息和ニ級結(jié)構(gòu)圖譜。結(jié)合一級結(jié)構(gòu)同源性和ニ級結(jié)構(gòu)將序列分為9個家族，從每個家族中選出I條結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能級較低的序列為代表進行下一步鑒定，共9條。
6、適配子與黃曲霉毒素B1親和力和特異性測定6. I適配子親和力分析根據(jù)AFB1Iptamer的一、二級結(jié)構(gòu)特征，把測序得到的所有序列進行分組，從每組中挑選出能級較低，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定的一條序列，由上海生工合成并在其5’端標記生物素。將合成的9條標有生物素的AFBi-aptamer與親和素化的磁珠組裝成適配體探針，用BB分別稀釋成10、20、40、60、80、100、120、150鹽01/1，再在上述不同濃度適配子的溶液中加入AFB1 (應用中的AFB1用甲醇-BB溶解)，使AFB1的最后濃度為1000ng/L，37°C、3000rpm搖床孵育lh，磁分離棄上清，用BB反復沖洗5次，在激發(fā)波長375nm，發(fā)射波長425nm,電壓800V下測磁珠上的熒光強度，平行三次，應用GraphPad Prism5軟件計算各個代表序列的解離常數(shù)&值，并繪制各不同濃度適配子對AFB1的飽和曲線，結(jié)果如圖2所示。
表I
權利要求
1.ー組特異識別黃曲霉毒素B1的寡核苷酸適配子，其寡核苷酸序列為 1)序列表中序列1、2、3所示的序列； 2)序列表中序列1所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個或幾個核苷酸形成的具有序列表中序列1同等功能的序列； 3)序列表中序列2所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個或幾個核苷酸形成的具有序列表中序列2同等功能的序列； 4)序列表中序列3所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個或幾個核苷酸形成的具有序列表中序列3同等功能的序列。
2.權利要求1所述的寡核苷酸適配子在檢測食品中黃曲霉毒素B1方面的應用。
3.根據(jù)權利要求2中所述的應用，其特征在于所述寡核苷酸適配子的5’端或3’端可以經(jīng)過FITC,或FAM,或生物素,或地高辛標記。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組黃曲霉毒素B1的寡核苷酸適配子。通過SELEX技術獲得了能夠特異識別黃曲霉毒素B1的單鏈DNA寡核苷酸適配子，該適配子可以通過熒光素標記等轉(zhuǎn)為報告適配子用于檢測黃曲霉毒素B1，該適配子序列在準確、快速檢出食品中的黃曲霉毒素B1方面具有廣泛應用前景。
文檔編號C12N15/115GK102952802SQ201210370140
公開日2013年3月6日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者王周平, 王文鳳, 段諾, 吳世嘉, 夏雨, 馬小媛 申請人:江南大學