專利名稱：單核苷酸多態(tài)性rs2735591在檢測麻風病易感基因中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及單核苷酸多態(tài)性rs2735591在檢測麻風病易感基因中的應用。
背景技術：
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)指基因組單個核苷酸的變異，它是最微小的變異單元，是由單個核苷酸對置換、顛換、插入或缺失所形成的變異形式。單核苷酸多態(tài)性是基因組上高密度的遺傳標志，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)的SNP數量超過3000萬。作為第三代遺傳標記SNP數量眾多、分布密集，易于檢測，因而是理想的基因 分型目標。SNP分型檢測在疾病基因組(如疾病易感性)，藥物基因組(藥效、藥物代謝差異和不良反應)和群體進化等研究中具有重大意義。目前已有多種方法可用于SNP檢測，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構象多態(tài)性、變性高效液相色譜、SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸雜交反應的芯片、基于單堿基延伸反應的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應的芯片、基于“一步法”反應的芯片、基于引物連接反應的芯片、基于限制性內切酶反應的芯片、基于蛋白DNA結合反應的芯片，及基于熒光分子DNA結合反應的芯片(張小燕等。用基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性反應原理。中國生物工程雜志。2005，25(11):52 56)。麻風病是一種由麻風分枝桿菌感染所致的慢性傳染病，在發(fā)展中國家這仍然是一個嚴重的健康問題，每年全球新發(fā)病例數為250000。主要侵犯皮膚和外周神經，并導致不可逆性的神經功能損害和慢性致畸致殘。這已被證明在麻風的流行中環(huán)境因素和宿主遺傳因素起著至關重要的作用，估計遺傳因素高達57%。世界衛(wèi)生組織的方案把麻風病的臨床表現(xiàn)分為結核型和瘤型，分別對應了 Thl (細胞介導)和Th2 (體液介導)組織的人體的免疫應答。麻風病多樣性的臨床表現(xiàn)反映出人體對同種病原體的兩種截然不同的免疫應答，這就說明遺傳易感性在麻風發(fā)病中的重要性。遺傳研究的結果表明遺傳與麻風易感性和其臨床亞型的病情進展都有關聯(lián)。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供單核苷酸多態(tài)性rs2735591在麻風病方面的新用途。本發(fā)明所提供的新用途是下述I) -9)中的至少一種I)檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備檢測與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品中的應用；2)檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備鑒定或輔助鑒定與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品中的應用；3)檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備篩查麻風病患者產品中的應用；
4)檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備檢測麻風病易感性產品中的應用；5)人基因組中的單核苷酸多態(tài)性在制備檢測麻風病易感基因的產品中的應用，其中，所述單核苷酸多態(tài)性是refSNP ID為rs2735591的DNA序列多態(tài)性；6)人基因組中的單核苷酸多態(tài)性在制備鑒定或輔助鑒定麻風病易感基因的產品中的應用，其中，所述單核苷酸多態(tài)性是refSNP ID為rs2735591的DNA序列多態(tài)性；7)人基因組中rs2735591的多態(tài)性在制備篩查麻風病患者產品中的應用；8)人基因組中rs2735591的多態(tài)性在制備檢測麻風病易感性產品中的應用；9)包括檢測人基因組中rs2735591多態(tài)性的物質的產品，為a)_d)中的任一種產 品a)檢測與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品，b)鑒定或輔助鑒定與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品，c)篩查麻風病患者產品，d)檢測麻風病易感性產品。 在本發(fā)明的實施例中，所述麻風病具體為中國漢族人群麻風病。rs2735591是人染色體Ip 22上的一個二等位多態(tài)性的SNP位點，該變異是轉換(C/T，在其互補鏈上則為G/A)。所述rs2735591基因型是CC、CT或TT。所述CC是rs2735591位點為C的純合型，所述TT是rs2735591位點為T的純合型，所述CT是rs2735591位點為T和C的雜合型。所述檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型具體可為檢測rs2735591的核苷酸種類。實驗證明，rs2735591在由3148個麻風病患者組成的病例群體和由7843個正常人組成的病例對照群體的P值是I. 03X 10_9，相對危險度是I. 24，說明rs2735591是與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性。距離rs2735591 2kb的BCLlO經實驗證明是一種新的麻風病易感基因，另外在rs2735591的連鎖區(qū)域還發(fā)現(xiàn)兩個候選的易感基因Clorf52和DDAH1。Clorf52 和 DDAHl 與 BCLlO 相毗鄰。實驗證明，rs2735591的三個基因型中，CC基因型的個體在正常人群體中的比例是49. 2%，明顯高于麻風病患者群體中的比例39. 9%。在實際應用中，可將檢測rs2735591的多態(tài)性的物質與其它物質(如檢測其它的與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的物質)聯(lián)合在一起制備篩查麻風病患者的產品。其中，檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性的物質可為通過下述至少一種方法確定rs2735591的多態(tài)性所需的試劑和/或儀器DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構象多態(tài)性、變性高效液相色譜和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸雜交反應的芯片、基于單堿基延伸反應的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應的芯片、基于“一步法”反應的芯片、基于引物連接反應的芯片、基于限制性內切酶反應的芯片、基于蛋白DNA結合反應的芯片，及基于熒光分子DNA結合反應的芯片。所述產品可為試劑或試劑盒，還可為試劑或試劑盒和儀器的組合產品，如由引物和DNA測序儀組成的組合產品，由PCR試劑和DNA測序試劑和DNA測序儀組成的組合產品。本發(fā)明的一個實施例中，采用PCR引物擴增包括rs2735591在內的基因組DNA片段，以得到的PCR擴增產物為模板，采用單堿基延伸引物進行單堿基延伸反應，對得到的延伸產物的序列進行檢測，確定rs2735591的多態(tài)性和基因型。所述PCR引物在序列上沒有特殊要求，只要能擴增出包括rs2735591在內的基因組DNA片段即可，具體可為序列I和序列2所示的單鏈DNA。所述延伸引物根據人基因組中rs2735591上游(不包括該SNP位點)設計，所述延伸引物的最后I位核苷酸對應于人基因組中rs2735591的前I位核苷酸，如所述延伸引物具體可為TCCCTGTTTTATTTTTTCCTCTTAG(序列表中的序列3)，當然也可將序列3所示的單鏈DNA按照人基因組中rs2735591的上游序列延長一個以上核苷酸，或按照人基因組中rs2735591的上游序列缺失一個以上核苷酸，只要能使該單堿基延伸引物的3'末端延伸出rs2735591位點的核苷酸即可。本發(fā)明基于GWAS數據，以Toll和CARD為候選基因研究單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群麻風病遺傳易感性的關系，發(fā)現(xiàn)rs2735591是與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性。可將檢測rs2735591的多態(tài)性的物質與其它物質(如檢測其它的與麻風病相關的單核苷酸多 態(tài)性的物質)聯(lián)合在一起制備篩查麻風病患者的產品。


圖I為rs2735591的關聯(lián)區(qū)域。左側縱軸顯示為SNP的P值，右側縱軸顯示為重組率，橫軸顯示其物理位置，三角形所示的SNP為rs2735591。重組率的估算基于千人基因組中中國及日本人群樣本。圖中注釋的基因源于(http: //genome, ucsc. edu/)。圖2為BCLlO在病損組織和正常組織中的相對表達量。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、rs2735591是與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性2009年發(fā)明人所在研究小組采用全基因組關聯(lián)研究(GWAS)在中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)了麻風病的7個易感基因(CCDC122，C13orf31, N0D2, TNFSF15, HLA-DR、RIPK2和LRRK2)，其中5個基因以N0D2為中心建立起一個信號通路(Zhang, F.R. , Huang, ff. , Chen, S, Μ. , Sun, L. D. , Liu, H. , Li, Y. , Cui, Y. , Yan, X. X. , Yang, H.Τ. , Yang, R. D. et al. (2009)Genomewide association study of leprosy. N. Engl.J. Med.，361，2609-2618.)，2011年繼GWAS后又發(fā)現(xiàn)了 2個麻風易感基因(IL23R和RAB32) (Zhang, F.，Liu, H.，Chen, S.，Low, H.，Sun, L.，Cui, Y.，Chu, T.，Li, Y.，F(xiàn)u, X.，Yu, Y.et al. (2011) Identification of two new loci at IL23R and RAB32 that influencesusceptibility to leprosy. Nat. Genet.，43，1247-1251.)。麻風病作為一類多個微效基因共同起作用的復雜性疾病，目前發(fā)現(xiàn)的9個易感基因位點僅是其易感基因譜的冰山一角，更多的麻風易感基因尚待進一步發(fā)現(xiàn)。倫理聲明本研究通過了山東省醫(yī)學科學院皮膚病與性病學研究機構倫理委員會批準，所有麻風病患者及正常對照者均簽署了知情同意書。
研究對象來自中國漢族人群的三個獨立樣本，這三個獨立樣本中共有3148名麻風病患者，7843名正常對照者。他們均為無血緣關系的獨立個體。臨床分型、家族史情況及發(fā)病年齡等信息通過病歷采集。樣本均通過標本的質控。所有的麻風病患者及正常對照者均來自中國北方，年齡、性別及籍貫均相匹配。麻風病患者的診斷至少由兩名皮膚科專家同時確診(臨床依據包括爪形手、畸形足及病理依據等)。正常對照者均無麻風家族史及其他面議疾病病史。獨立樣本I由706名麻風病患者病例及514名正常對照者組成；獨立樣本2(驗證樣本I)共1504名麻風病患者及1502名正常對照者；獨立樣本3 (驗證樣本2)共938名麻風病患者及5827名正常對照者。其中，中國麻風病患者的診斷標準是符合下述4條中的2條或2條以上，或符合第3條者確立診斷1、皮損伴有感覺障礙及閉汗，或有麻木區(qū)；2、周圍神經受累，表現(xiàn)為神經 干粗大伴相應功能障礙；3、皮損組織切片或組織液涂片查到麻風桿菌；4、病理可見特征性 改變。正常對照者的診斷標準無麻風病史及其他傳染病病史，無其他自身免疫性疾病病史及家族史。表I顯示了驗證樣本I和驗證樣本2的基本信息。表1、2442名中國麻風病患者和7329名正常對照者的基本情況
權利要求
1.檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備檢測與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品中的應用。
2.檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備鑒定或輔助鑒定與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品中的應用。
3.檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備篩查麻風病患者產品中的應用。
4.檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備檢測麻風病易感性產品中的應用。
5.人基因組中的單核苷酸多態(tài)性在制備檢測麻風病易感基因的產品中的應用，其特征在于所述單核苷酸多態(tài)性是refSNP ID為rs2735591的DNA序列多態(tài)性。
6.人基因組中的單核昔Ife多態(tài)性在制備鑒定或輔助鑒定麻風病易感基因的廣品中的應用，其特征在于所述單核苷酸多態(tài)性是refSNP ID為rs2735591的DNA序列多態(tài)性。
7.人基因組中rs2735591的多態(tài)性在制備篩查麻風病患者產品中的應用。
8.人基因組中rs2735591的多態(tài)性在制備檢測麻風病易感性產品中的應用。
9.含有檢測人基因組中rs2735591多態(tài)性的物質的產品，為a)_d)中的任一種產品 a)檢測與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品； b)鑒定或輔助鑒定與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品； c)篩查麻風病患者產品； d)檢測麻風病易感性產品。
10.根據權利要求9所述的產品，其特征在于所述檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性的物質含有擴增包括rs2735591在內的基因組DNA片段的PCR引物和單堿基延伸引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了單核苷酸多態(tài)性rs2735591在檢測麻風病易感基因中的應用。本發(fā)明所保護的一個技術方案是檢測人基因組中rs2735591的多態(tài)性或基因型的物質在制備檢測與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的產品中的應用?？蓪z測rs2735591的多態(tài)性的物質與其它物質(如檢測其它的與麻風病相關的單核苷酸多態(tài)性的物質)聯(lián)合在一起制備篩查麻風病患者的產品。
文檔編號C12Q1/68GK102899413SQ201210372030
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者田洪青, 劉紅, 張福仁 申請人:山東省皮膚病性病防治研究所