專利名稱：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性rs6871626在檢測(cè)麻風(fēng)病易感基因中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單核苷酸多態(tài)性rs6871626在檢測(cè)麻風(fēng)病易感基因中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)指基因組單個(gè)核苷酸的變異，它是最微小的變異單元，是由單個(gè)核苷酸對(duì)置換、顛換、插入或缺失所形成的變異形式。單核苷酸多態(tài)性是基因組上高密度的遺傳標(biāo)志，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)的SNP數(shù)量超過3000萬(wàn)。作為第三代遺傳標(biāo)記SNP數(shù)量眾多、分布密集，易于檢測(cè)，因而是理想的基因分型目標(biāo)。SNP分型檢測(cè)在疾病基因組(如疾病易感性)，藥物基因組(藥效、藥物代謝差異和不良反應(yīng))和群體進(jìn)化等研究中具有重大意義。目前已有多種方法可用于SNP檢測(cè)，如DNA測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性、單 鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜、SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片(張小燕等。用基因芯片檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理。中國(guó)生物工程雜志。2005，25(11):52 56)。麻風(fēng)病是一種由麻風(fēng)分枝桿菌感染所致的慢性傳染病，在發(fā)展中國(guó)家這仍然是一個(gè)嚴(yán)重的健康問題，每年全球新發(fā)病例數(shù)為250000。主要侵犯皮膚和外周神經(jīng)，并導(dǎo)致不可逆性的神經(jīng)功能損害和慢性致畸致殘。這已被證明在麻風(fēng)的流行中環(huán)境因素和宿主遺傳因素起著至關(guān)重要的作用，估計(jì)遺傳因素高達(dá)57%。世界衛(wèi)生組織的方案把麻風(fēng)病的臨床表現(xiàn)分為結(jié)核型和瘤型，分別對(duì)應(yīng)了 Thl (細(xì)胞介導(dǎo))和Th2 (體液介導(dǎo))組織的人體的免疫應(yīng)答。麻風(fēng)病多樣性的臨床表現(xiàn)反映出人體對(duì)同種病原體的兩種截然不同的免疫應(yīng)答，這就說明遺傳易感性在麻風(fēng)發(fā)病中的重要性。遺傳研究的結(jié)果表明遺傳與麻風(fēng)易感性和其臨床亞型的病情進(jìn)展都有關(guān)聯(lián)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供單核苷酸多態(tài)性rs6871626在麻風(fēng)病方面的新用途。本發(fā)明所提供的新用途是下述I) -9)中的至少一種I)檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；2)檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；
4)檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；5)人基因組中的單核苷酸多態(tài)性在制備檢測(cè)麻風(fēng)病易感基因的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，所述單核苷酸多態(tài)性是refSNP ID為rs6871626的DNA序列多態(tài)性；6)人基因組中的單核苷酸多態(tài)性在制備鑒定或輔助鑒定麻風(fēng)病易感基因的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，所述單核苷酸多態(tài)性是refSNP ID為rs6871626的DNA序列多態(tài)性；7)人基因組中rs6871626的多態(tài)性在制備篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；8)人基因組中rs6871626的多態(tài)性在制備檢測(cè)麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；9)包括檢測(cè)人基因組中rs6871626多態(tài)性的物質(zhì)的產(chǎn)品，為a)_d)中的任一種產(chǎn)品
a)檢測(cè)與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品，b)鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品，c)篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品，d)檢測(cè)麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品。 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述麻風(fēng)病具體為中國(guó)漢族及少數(shù)民族人群麻風(fēng)病。Rs6871626是人染色體5q33上的一個(gè)二等位多態(tài)性的SNP位點(diǎn)，該變異是轉(zhuǎn)換(A/C，在其互補(bǔ)鏈上則為T/G)。所述rs6871626基因型是AA、AC或CC。所述AA是rs6871626位點(diǎn)為A的純合型，所述CC是rs6871626位點(diǎn)為C的純合型，所述AC是rs6871626位點(diǎn)為A和C的雜合型。所述檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型具體可為檢測(cè)rs6871626的核苷酸種類。實(shí)驗(yàn)證明，rs6871626在由5503個(gè)麻風(fēng)病患者組成的病例群體和由4971個(gè)正常人組成的病例對(duì)照群體的P值是3. 95X 10_18，相對(duì)危險(xiǎn)度是O. 75，說明rs6871626是與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。實(shí)驗(yàn)證明，rs6871626的三個(gè)基因型中，CC基因型的個(gè)體在正常人群體中的比例是45. 5%，明顯低于麻風(fēng)病患者群體中的比例51. 5%。在實(shí)際應(yīng)用中，可將檢測(cè)rs6871626的多態(tài)性的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測(cè)其它的與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查麻風(fēng)病患者的產(chǎn)品。其中，檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性的物質(zhì)可為通過下述至少一種方法確定rs6871626的多態(tài)性所需的試劑和/或儀器DNA測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片。所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為試劑或試劑盒和儀器的組合產(chǎn)品，如由引物和DNA測(cè)序儀組成的組合產(chǎn)品，由PCR試劑和DNA測(cè)序試劑和DNA測(cè)序儀組成的組合產(chǎn)品。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用PCR引物擴(kuò)增包括rs6871626在內(nèi)的基因組DNA片段，以得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用單堿基延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，對(duì)得到的延伸產(chǎn)物的序列進(jìn)行檢測(cè)，確定rs6871626的多態(tài)性和基因型。所述PCR引物在序列上沒有特殊要求，只要能擴(kuò)增出包括rs6871626在內(nèi)的基因組DNA片段即可，具體可為序列I和序列2所示的單鏈DNA。所述延伸引物根據(jù)人基因組中rs6871626上游(不包括該SNP位點(diǎn))設(shè)計(jì)，所述延伸引物的最后I位核苷酸對(duì)應(yīng)于人基因組中rs6871626的前I位核苷酸，如所述延伸引物具體可為序列表中的序列5所示的單鏈DMNA，當(dāng)然也可將序列5所示的單鏈DNA按照人基因組中rs6871626的下游序列延長(zhǎng)一個(gè)以上核苷酸，或按照人基因組中rs6871626的下游序列缺失一個(gè)以上核苷酸，只要能使該單堿基延伸引物的3'末端延伸出rs6871626位點(diǎn)的核苷酸即可。本發(fā)明在一個(gè)來自中國(guó)人群的樣本(5503個(gè)麻風(fēng)病患者和4971個(gè)健康者)中發(fā)現(xiàn)rs6871626是與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性?？蓪z測(cè)rs6871626的多態(tài)性的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測(cè)其它的與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查麻風(fēng)病患者的產(chǎn)品。


圖I為rs2058660的關(guān)聯(lián)區(qū)域。 左側(cè)縱軸顯示為SNP的P值，右側(cè)縱軸顯示為重組率，橫軸顯示其物理位置。各區(qū)域中SNP與本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性SNP位點(diǎn)rs2058660的相關(guān)系數(shù)(r2)用不同顏色標(biāo)記，箭頭指示的為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性SNP rs2058660、區(qū)域中P值最小SNP位點(diǎn)以及以往報(bào)道過的SNP，P值最小的SNP位點(diǎn)rsl916307、以往報(bào)道與哮喘相關(guān)的位點(diǎn)rs3771166均與本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性SNP位點(diǎn)rs2058660無(wú)關(guān)聯(lián)，與乳糜瀉相關(guān)的位點(diǎn)rs917997、rsl3015714與陽(yáng)性位點(diǎn)強(qiáng)關(guān)聯(lián)(r2 >0.8)。重組率的估算基于千人基因組中中國(guó)及日本人群樣本。圖中注釋的基因源于(http://genome, ucsc. edu/)。圖2為rs6871626的關(guān)聯(lián)區(qū)域。左側(cè)縱軸顯示為SNP的P值，右側(cè)縱軸顯示為重組率，橫軸顯示其物理位置。各區(qū)域中SNP與本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性SNP位點(diǎn)rs6871626的相關(guān)系數(shù)(r2)用不同顏色標(biāo)記，箭頭指示的為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性SNP rs6871626、區(qū)域中P值最小SNP位點(diǎn)以及以往報(bào)道過的SNP，P值最小的位點(diǎn)rsl422877以及與克羅恩氏病相關(guān)的rsl0045431，多發(fā)性硬化癥相關(guān)的rs2546890，銀屑病相關(guān)的rs2546890、rs3213094、rs2082412,關(guān)節(jié)病型銀屑病相關(guān)的rsl2188300，強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的rs6556416均與陽(yáng)性SNP位點(diǎn)rs6871626無(wú)關(guān)聯(lián)(r2 < O. 01)。重組率的估算基于千人基因組中中國(guó)及日本人群樣本。圖中注釋的基因源于(http://genome, ucsc.edu/)ο
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、rs6871626是與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性2009年發(fā)明人所在研究小組采用全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)在中國(guó)漢族人群中發(fā)現(xiàn)了麻風(fēng)病的7個(gè)易感基因(CCDC122，C13orf31, N0D2, TNFSF15, HLA-DR、RIPK2和LRRK2)，其中5個(gè)基因以N0D2為中心建立起一個(gè)信號(hào)通路(Zhang, F.R.，Huang, W.，Chenj S，Μ.，Sun, L. D.，Liuj H.，Li，Y.，Cuij Y.，Yanj X. X.，Yang, Η.Τ. , Yang, R. D. et al. (2009)Genomewide association study of leprosy. N. Engl.J. Med.，361，2609-2618.)，2011 年繼 GffAS 后又發(fā)現(xiàn)了 2 個(gè)麻風(fēng)易感基因(IL23R 和 RAB32)(Zhang, F. , Liu, H. , Chen, S. , Low, H. , Sun, L. , Cui, Y. , Chu, T. , Li, Y. , Fu, X. , Yu, Y. etal. (2011)Identification of two new loci at IL23R and RAB32that influence)。麻風(fēng)病作為一類多個(gè)微效基因共同起作用的復(fù)雜性疾病，目前發(fā)現(xiàn)的9個(gè)易感基因位點(diǎn)僅是其易感基因譜的冰山一角，更多的麻風(fēng)易感基因尚待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。候選基因及SNP的選擇發(fā)明人通過PUBMED 的 GWAS 官網(wǎng)(http://www. genome, gov/26525384)，查閱了 12個(gè)⑶(克羅恩病)的GWAS研究和2個(gè)UC (潰瘍性結(jié)腸炎)的GWAS研究。從中選出位于118個(gè)基因上的155個(gè)與⑶或UC或兩者相關(guān)的SNPs (ρ〈5. 0Χ1(Γ8)。排除位于MHC區(qū)域的7個(gè)SNP和15個(gè)位于5個(gè)已知的麻風(fēng)易感基因(N0D2，TNFSFl5, IL23R, C130RF31和LRRK2)上的SNPs。剩余的133個(gè)SNPs，包括75個(gè)CD的相關(guān)SNPs，54個(gè)UC相關(guān)的SNPs，41個(gè)IBD(MM266600)(⑶和UC)相關(guān)的SNPs。這些點(diǎn)將在來自中國(guó)人群的4個(gè)獨(dú)立樣本中被驗(yàn)證。
倫理聲明本研究通過了山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病與性病學(xué)研究機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有麻風(fēng)病患者及健康對(duì)照者均簽署了知情同意書。研究對(duì)象來自中國(guó)人群的四個(gè)獨(dú)立樣本，這四個(gè)獨(dú)立樣本中共有4971名麻風(fēng)病患者，5503名健康對(duì)照者。他們均為無(wú)血緣關(guān)系的獨(dú)立個(gè)體。臨床分型、家族史情況及發(fā)病年齡等信息通過病歷采集。樣本均通過標(biāo)本的質(zhì)控。麻風(fēng)病患者的診斷至少由兩名皮膚科專家同時(shí)確診(臨床依據(jù)包括爪形手、畸形足及病理依據(jù)等)。健康對(duì)照者均無(wú)麻風(fēng)家族史及其他面議疾病病史。其中，中國(guó)麻風(fēng)病患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)是符合下述4條中的2條或2條以上，或符合第3條者確立診斷1、皮損伴有感覺障礙及閉汗，或有麻木區(qū)；2、周圍神經(jīng)受累，表現(xiàn)為神經(jīng)干粗大伴相應(yīng)功能障礙；3、皮損組織切片或組織液涂片查到麻風(fēng)桿菌；4、病理可見特征性改變。健康對(duì)照者的診斷標(biāo)準(zhǔn)無(wú)麻風(fēng)病史及其他傳染病病史，無(wú)其他自身免疫性疾病病史及家族史。表I顯不了樣本1-4的基本信息。表1、4971名中國(guó)麻風(fēng)病患者和5503名健康對(duì)照者的基本情況
權(quán)利要求
1.檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.人基因組中的單核苷酸多態(tài)性在制備檢測(cè)麻風(fēng)病易感基因的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于所述單核苷酸多態(tài)性是refSNP ID為rs6871626的DNA序列多態(tài)性。
6.人基因組中的單核昔Ife多態(tài)性在制備鑒定或輔助鑒定麻風(fēng)病易感基因的廣品中的應(yīng)用，其特征在于所述單核苷酸多態(tài)性是refSNP ID為rs6871626的DNA序列多態(tài)性。
7.人基因組中rs6871626的多態(tài)性在制備篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.人基因組中rs6871626的多態(tài)性在制備檢測(cè)麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.含有檢測(cè)人基因組中rs6871626多態(tài)性的物質(zhì)的產(chǎn)品，為a)-d)中的任一種產(chǎn)品 a)檢測(cè)與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品； b)鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品； c)篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品； d)檢測(cè)麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品，其特征在于所述檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性的物質(zhì)含有擴(kuò)增包括rs6871626在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和單堿基延伸引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了單核苷酸多態(tài)性rs6871626在檢測(cè)麻風(fēng)病易感基因中的應(yīng)用。本發(fā)明所保護(hù)的一個(gè)技術(shù)方案是檢測(cè)人基因組中rs6871626的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用?？蓪z測(cè)rs6871626的多態(tài)性的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測(cè)其它的與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查麻風(fēng)病患者的產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102876794SQ201210375609
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者劉紅, 劉健, 張福仁 申請(qǐng)人:山東省皮膚病性病防治研究所