專(zhuān)利名稱(chēng)：拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物防治領(lǐng)域，涉及一株木霉菌菌株及其用途，尤其涉及一株拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株及其用途。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著耕作和栽培制度的改變、品種輪換及高油高淀粉品種大面積種植，玉米的土傳病害有逐年加重的趨勢(shì)，一般年份發(fā)病率大約在10-30%，嚴(yán)重年份甚至可以達(dá)到60%以上，從而導(dǎo)致玉米產(chǎn)量顯著降低。因此，土傳病害已成為玉米穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要制約因素之一。而我國(guó)玉米的主要土傳病害有4種，即莖基腐病、絲黑穗病、紋枯病和全蝕病，其中莖基腐病和紋枯病的危害尤為嚴(yán)重。玉米莖腐病(Corn Stalk Rot)，又稱(chēng)玉米青枯病，其分布廣、危害重，世界玉米各 產(chǎn)區(qū)均普遍發(fā)生，給玉米生產(chǎn)造成很大損失，一般年份發(fā)病率為10-20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%以上，導(dǎo)致玉米減產(chǎn)20-30%。絕大多數(shù)研究證明，引起玉米莖腐病的病原菌是一個(gè)致病菌的群體，而且不同地區(qū)的病原菌不完全相同，或完全不同。目前，從病殘?bào)w中分離到的致病菌有腐霉菌、鐮刀菌、干腐菌、炭疽菌和細(xì)菌等。國(guó)內(nèi)近年來(lái)有關(guān)莖腐病病原菌的種類(lèi)存在3種不同的觀點(diǎn)腐霉菌是主要的致病菌；鐮刀菌是主要致病菌；腐霉菌和鐮刀菌復(fù)合侵染所致。玉米紋枯病(Rhizoctonia solani)是世界上玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、危害嚴(yán)重的世界性病害之一，在我國(guó)始見(jiàn)于1966年的吉林省，后在四川、貴州、江蘇、浙江、河南、河北、安徽、遼寧、黑龍江、吉林、山西、陜西、山東等省及兩湖、兩廣地區(qū)的春、夏、秋玉米均有發(fā)生。20世紀(jì)70年代后，隨著玉米種植面積的擴(kuò)大，雜交種的推廣應(yīng)用，施肥量及種植密度的提高，玉米紋枯病的發(fā)生、發(fā)展和蔓延日趨嚴(yán)重；特別在我國(guó)西南玉米種植地區(qū)，由于玉米生長(zhǎng)期氣溫高、濕度大，紋枯病已經(jīng)成為玉米第一大病害研究發(fā)現(xiàn)，目前其紋主要病原菌是立枯絲核菌。為了有效防治以上玉米病害、保證我國(guó)玉米產(chǎn)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，必然需要進(jìn)行玉米病害的綜合防治，即從玉米田間生態(tài)系統(tǒng)的整體觀念出發(fā)，以農(nóng)業(yè)防治為基礎(chǔ)，協(xié)調(diào)運(yùn)用生物防治和化學(xué)防治等各項(xiàng)措施，將病害的發(fā)生為害控制在經(jīng)濟(jì)允許損失水平以下，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)的三大效益。其中，生物防治廣受政府、農(nóng)莊及農(nóng)戶關(guān)注，生防微生物資源研究中高效拮抗菌株成為重中之重。而木霉菌，作為國(guó)際公認(rèn)的生防菌，尋找具高效生防能力的木霉菌株迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)測(cè)定、拮抗相關(guān)酶活測(cè)定、盆栽接種試驗(yàn)及抗生性次生代謝物提取分析的方法，提供一種高拮抗性、強(qiáng)專(zhuān)化性的拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株，該菌株能夠用于生產(chǎn)高效且快速防治玉米莖腐病和紋枯病的生物農(nóng)藥。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，
第一方面，本發(fā)明涉及一種拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株為深綠木霉(Trichoderma atroviride) SG3403CGMCC No. 6479。優(yōu)選地，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID NO. I所示。第二方面，本發(fā)明還涉及前述木霉菌菌株在制備防治玉米莖腐病和紋枯病農(nóng)藥中的用途。本發(fā)明提供的木霉菌菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101 ;本發(fā)明菌株的信息為深綠木霉(Trichoderma atroviride) SG3403 ;保藏號(hào)為CGMCC No. 6479 ;保藏日期為 2012. 8. 28。菌株培養(yǎng)特征包括在PDA和SNA上的最適合生長(zhǎng)溫度為25_30°C，25°C PDA培養(yǎng)3d,菌落半徑為 42. 8-60. 5mm ；25°C SNA 培養(yǎng) 3d，菌落半徑為 22. 2-35. 5mm。在 PDA 上 30°C 培養(yǎng)96h，菌落邊界清晰，中央有一菌絲相對(duì)致密的圓盤(pán)狀結(jié)構(gòu)，是分生孢子的主要產(chǎn)生區(qū)域；一般沒(méi)有分生孢子堆，有椰子氣味(甜味)。菌株形態(tài)特征包括分生孢子梗的可育延伸物沒(méi)有或者很少產(chǎn)生，沒(méi)有不育的菌毛；雖然成對(duì)著生的分枝比較常見(jiàn)，但分生孢子梗的典型分枝方式為單側(cè)分枝，分枝角度為近似90°。瓶梗長(zhǎng)度為4. 2 15. Oym,長(zhǎng)寬比值為I. I 6. 3，直或者彎曲，有時(shí)候?yàn)殂^狀；2 4個(gè)呈漩渦狀排列，常為單生；漩渦狀排列中的最頂端瓶梗及單生瓶梗一般為圓柱形，只在尖端下部縊縮，形成細(xì)頸樣形狀；尖端下面著生的瓶梗為燒瓶形，中部膨大，至頂縊縮，基部稍微縊縮；瓶梗的支持細(xì)胞寬度與瓶?；肯嗨啤](méi)有間生瓶梗。分生孢子綠色，亞球形至卵圓形，沒(méi)有明顯的脫落痕跡，光滑，3. O 5. 0μ mX2. 3 4. Ομπι,長(zhǎng)寬比值為
0.8 I. 6，干燥。本發(fā)明采集華東地區(qū)農(nóng)田土壤，并于4°C保藏，再分離純化菌株，然后依次進(jìn)行離體對(duì)峙病原菌抑制試驗(yàn)(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)、檢測(cè)拮抗相關(guān)酶酶活(幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)和活體接菌防效試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)以上步驟反復(fù)篩選，最終選出高拮抗性、強(qiáng)專(zhuān)化性的殺玉米莖腐病和紋枯病病害的木霉菌菌株，編號(hào)為SG3403。為了該菌株更好地開(kāi)發(fā)利用，進(jìn)行了抗生性次生代謝物質(zhì)分析，明確了在拮抗中起作用的物質(zhì)的比例。通過(guò)菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形態(tài)特征鑒定以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間區(qū)核酸序列測(cè)定和分析，其ITS序列如序列表中的序列I所示，從而確定了該菌株的分類(lèi)地位木霉屬(Trichoderma Pers. ex Fr.),深綠木霉(Trichoderma atroviride)。本發(fā)明提供的木霉菌菌株生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量大、離體對(duì)峙病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)抑制率分別達(dá)71. 91%,74. 77%,73. 11%，幾丁質(zhì)酶酶活為4. 1452U，β -I, 3-葡聚糖酶酶活為0. 5969U，胞外蛋白酶酶活為2. 4845U。該菌株能夠用于生產(chǎn)高效且快速防治玉米莖腐病和紋枯病的生物農(nóng)藥。


通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯圖I為本發(fā)明SG3403菌株中不同類(lèi)型的抗生性次生代謝物分配比例結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過(guò)采集山東省壽光市芹菜蔬菜地土壤，并于4°C保藏土壤，再分離純化野生菌株1026株木霉菌，然后依次進(jìn)行離體對(duì)峙病原菌抑制試驗(yàn)(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)、檢測(cè)拮抗相關(guān)酶酶活(幾丁質(zhì)酶、β -I, 3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)、活體接菌防效試驗(yàn)和抗生性次生代謝物提取分析，經(jīng)過(guò)以上步驟反復(fù)篩選，最終選出高拮抗性、強(qiáng)專(zhuān)化性的殺玉米莖腐病和紋枯病病害的木霉菌菌株，編號(hào)為木霉菌SG3403。并通過(guò)菌株的菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形態(tài)特征鑒定以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間區(qū)核酸序列測(cè)定和分析確定該菌株的分類(lèi)地位。實(shí)施例I為離體對(duì)峙抑菌試驗(yàn)，實(shí)施例2 4為拮抗相關(guān)酶的酶活檢測(cè)試驗(yàn)，實(shí)施 例5為活體接菌防效試驗(yàn)，實(shí)施例6 7為抗生性次生代謝物提取分析試驗(yàn)。實(shí)施例I、離體對(duì)峙抑菌試齡制備PDA平板，用打孔器自培養(yǎng)3d的供試木霉菌和3株病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)菌落邊緣分別打取直徑5mm的菌塊，分別移植在平板相對(duì)的兩側(cè)中央，相距約5cm，28°C恒溫倒置培養(yǎng)，重復(fù)3次，以僅接種病原菌的平板作為對(duì)照。接種144h后分別測(cè)量三株病原菌的直線生長(zhǎng)距離和S。,，按如下公式計(jì)算抑制率抑制率(%)= (Sck-St)/SekX 100%，其中Sek表示對(duì)照組接種病原菌株144h后的直線生長(zhǎng)距離；St表示對(duì)峙培養(yǎng)組接種病原菌株144h后的直線生長(zhǎng)距離。表I菌株離體抑菌率的測(cè)定結(jié)果
病菌抑制率(%)
菌株 --—--
采谷濂刀蔭中珠籠力菌立枯絲核菌
SG340371.91~ 7-1.7773. 11[由表I可以看出，SG3403對(duì)三株病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)的抑制作用較好，分別為71. 91%,74. 77%,73. 11%。實(shí)施例2、幾丁質(zhì)酶酶活力檢測(cè)將木霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板(直徑90mm)上，在光照恒溫恒濕培養(yǎng)箱25°C、60%濕度培養(yǎng)5d。把長(zhǎng)滿木霉的平板用滅菌水浸泡3-5min，用棉簽輕輕刮洗下孢子及菌絲體，脫脂棉或4層紗布過(guò)濾除去菌絲體，濾液即為孢子懸浮液。根據(jù)血球記數(shù)板法進(jìn)行計(jì)數(shù)，稀釋后孢子懸浮液濃度為IO6個(gè)· mL—1孢子量。配制N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)(色譜純，Sigma Chemical Co. P. O. , Germany)的Img · ml/1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取6支25 X 250mm試管，按表2加入試劑，將各管混勻，在沸水中準(zhǔn)確煮5min，取出后立即冷卻至室溫，再向各試管加入21. 5mL蒸餾水，搖均。稀釋后各管NAG的濃度依次為0、8、12、16、20、24、28 ( μ g/mL)。先對(duì)7管樣品通過(guò)紫外分光光度計(jì)在200-700nm范圍進(jìn)行全波掃描，得到其最大吸收值的波長(zhǎng)。再對(duì)上述7支管在最大光吸收(OD)值的波長(zhǎng)下按NAG濃度從低到高測(cè)定吸光值，以NAG濃度(μ g/mL)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2建立NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑
權(quán)利要求
1.一種措抗玉米3；腐病和紋枯病的木霉囷囷株，其特征在于，所述木霉囷囷株為深綠木霉(Trichoderma atroviride) SG3403CGMCC No. 6479。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQID NO. I 所示。
3.—種如權(quán)利要求I所述的木霉菌菌株在制備防治玉米莖腐病和紋枯病農(nóng)藥中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物防治領(lǐng)域的拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株及其用途。所述木霉菌菌株為深綠木霉(Trichoderma atroviride)SG3403CGMCC No.6479；同時(shí)，本發(fā)明還涉及前述木霉菌菌株在制備防治玉米莖腐病和紋枯病農(nóng)藥中的用途。本發(fā)明提供的木霉菌菌株生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量大、離體對(duì)峙病原菌抑制率分別達(dá)71.91%、74.77%、73.11%，幾丁質(zhì)酶酶活為4.1452U，β-1,3-葡聚糖酶酶活為0.5969U，胞外蛋白酶酶活為2.4845U；本發(fā)明的菌株能夠用于生產(chǎn)高效且快速防治玉米莖腐病和紋枯病的生物農(nóng)藥。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102888349SQ20121037846
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者孫瑞艷, 陳捷, 曹磊, 劉志誠(chéng), 李雅乾, 姚麗美, 林振亞 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)