專利名稱：一種基因載體系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，涉及一種具有靶向功能和還原敏感響應(yīng)特性的基因載體。
背景技術(shù)：
在治療遺傳性疾病以及腫瘤方面，基因治療是一個(gè)很有前途的治療手段，在過(guò)去的十年中得到極大地推進(jìn)。然而，基因治療的瓶頸之一是基因的傳遞。核酸是帶負(fù)電的生物大分子，因此穩(wěn)定和高效的合成載體通常是帶正電的。人們開發(fā)了許多的陽(yáng)離子脂質(zhì)和聚合物載體系統(tǒng)，與DNA靜電結(jié)合，并用在體外促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染。聚乙烯亞胺(PEI)是非病毒類載體中受到關(guān)注最多的一個(gè)陽(yáng)離子聚合物，它已被·廣泛地作為黃金基準(zhǔn)的聚合物載體，但是PEI固有的細(xì)胞毒性和很高的表面正電荷，限制其在體內(nèi)的應(yīng)用。隨著對(duì)PEI基因載體轉(zhuǎn)染過(guò)程的逐漸認(rèn)識(shí)，對(duì)PEI/DNA進(jìn)行遮蔽的策略得到了發(fā)展，開發(fā)出多種多樣的遮蔽材料，如非離子型的親水性的聚乙二醇(PEG)、帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體和一些可降解的聚合物等。這些遮蔽材料或與PEI共價(jià)結(jié)合，或與PEI/DNA復(fù)合物靜電作用結(jié)合，從而屏蔽正電荷，降低毒性，防止鹽和血清白蛋白引起聚集，甚至達(dá)到腫瘤靶向性。但是由于這些遮蔽材料與基因載體結(jié)合牢固，在進(jìn)入細(xì)胞后不易脫落，依然將運(yùn)載的基因緊緊包裹，使其難以發(fā)揮作用，從而大大降低了基因轉(zhuǎn)染的效率。因此，開發(fā)出既具有較低的細(xì)胞毒性，有具有較高的轉(zhuǎn)染效率的基因載體是行業(yè)亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有基因載體遮蔽體系存在的不足，提供一種具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系，并將它與陽(yáng)離子聚合物和DNA復(fù)合，得到三元復(fù)合物基因載體，將其用于體外基因轉(zhuǎn)染、腫瘤、哮喘和心血管疾病的基因治療。透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid, HA)由于具有無(wú)毒無(wú)免疫原性，且對(duì)細(xì)胞表面CD44 (Cluster determinant 44), LYVE-I (lymphatic vessel endothelial hyaluronanreceptor-1)受體具有靶向作用而受到關(guān)注。本發(fā)明通過(guò)對(duì)透明質(zhì)酸上的至少一個(gè)葡萄糖醛酸單元上的羧基進(jìn)行修飾，得到的具有還原敏感的二硫鍵并且末端仍是羧基的透明質(zhì)酸衍生物(HA-SS-COOH ),提供了一種具有靶向配體的還原敏感型遮蔽體系。作為一種優(yōu)選，本發(fā)明中所述遮蔽體系中所用的透明質(zhì)酸的分子量為5000-2000000 道爾頓。本發(fā)明還提供了一種基因載體系統(tǒng)，由具有靶向功能和還原敏感特性的遮蔽體系、陽(yáng)離子高分子材料和質(zhì)粒DNA組成，所述陽(yáng)離子高分子材料和質(zhì)粒DNA復(fù)合形成復(fù)合物顆粒，所述遮蔽體系通過(guò)靜電作用遮蔽到復(fù)合物表面。作為一種優(yōu)選，本發(fā)明所述基因載體系統(tǒng)中的陽(yáng)離子高分子材料為聚乙烯亞胺，聚賴氨酸，聚酰胺-胺等聚陽(yáng)離子或魚精蛋白中的任意一種。
作為一種優(yōu)選，本發(fā)明所述基因載體系統(tǒng)中的質(zhì)粒DNA采用在真核細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒 DNA。作為一種優(yōu)選，本發(fā)明所述基因載體系統(tǒng)中遮蔽體系與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比例為O.
I 1-50 :1，陽(yáng)離子高分子材料與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比例為O. I :1_50 :1。本發(fā)明還提供了一種基因載體系統(tǒng)的制備方法，其具體步驟如下
(I)具有祀向功能的還原敏感遮蔽體系的制備
1)將透明質(zhì)酸溶于pH6. 8的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入I- (3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC ^HCl)和I-羥基苯并三唑(HOBT)，攪拌，活化羧基。加入胱胺二鹽酸鹽(Cys)，作為優(yōu)選，透明質(zhì)酸(HA)和胱胺二鹽酸鹽的質(zhì)量比在1:30-30:1之間，攪拌，上述反應(yīng)溶液在室溫下反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物透析，冷凍干燥，得到胱胺接枝的透明質(zhì)酸(HA-Cys)；
2)將胱胺接枝的透明質(zhì)酸(HA-Cys)溶于pH8. 5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入過(guò)量的二硫蘇糖醇(DTT)，在室溫下反應(yīng)4小時(shí)后，用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)pH值到3. 5，然后加入氯化鈉(NaCl)至終濃度為5% (質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))。隨后，用乙醇沉淀，再?gòu)?fù)溶于水，離心，冷凍干燥即可得到巰基化的透明質(zhì)酸(HA-SH)；
3)巰基化的透明質(zhì)酸(HA-SH)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，與過(guò)量的3-巰基丙酸在室溫下反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物透析，冷凍干燥，得到二硫鍵修飾且末端為羧基的透明質(zhì)酸(HA-SS-COOH)。(2)具有祀向功能的還原敏感遮蔽體系的基因載體系統(tǒng)的制備
將質(zhì)粒DNA溶于滅菌水中，獲得溶液A ;將陽(yáng)離子聚合物基因載體溶于HBG緩沖液(含4-羥乙基哌嗪乙磺酸20毫摩爾，5%葡萄糖，pH 7. 4的水溶液)中，得到溶液B ;將具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系(HA-SS-COOH)溶于HBG緩沖液中，得到溶液C ;A和B復(fù)合得到基因載體和質(zhì)粒DNA的復(fù)合物顆粒溶液，在室溫下放置20分鐘后，加入溶液C，得到一種具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系的基因載體系統(tǒng)。本發(fā)明的有益效果
I.本發(fā)明所述基因載體采用透明質(zhì)酸衍生物作為遮蔽體，一方面不會(huì)影響陽(yáng)離子聚合物對(duì)DNA的復(fù)合能力，另一方面利用透明質(zhì)酸的靶向功能提高了基因載體與細(xì)胞表面受體的結(jié)合效率，并通過(guò)HA受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用維持內(nèi)涵體脫離的能力，促進(jìn)PEI/DNA/HA-SS-COOH三元復(fù)合物被細(xì)胞攝取。2.本發(fā)明所述基因載體的遮蔽體系，一方面其末端的羧基可以與陽(yáng)離子聚合物和質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物顆粒表面帶有的大量氨基通過(guò)靜電作用相結(jié)合，達(dá)到遮蔽的作用，降低毒性及避免血清白蛋白引起的聚集，逃脫網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用，從而減少陽(yáng)離子聚合物的細(xì)胞毒性、增加血清穩(wěn)定性；另一方面，在進(jìn)入細(xì)胞后，在胞內(nèi)還原性環(huán)境的作用下，還原敏感的二硫鍵會(huì)發(fā)生斷裂，從而解除屏蔽作用，使裝載的基因暴露出來(lái)，提高其從內(nèi)涵體逃逸的能力，從而大大提高轉(zhuǎn)染效率。3.本發(fā)明所述基因載體，利用靜電結(jié)合的方法將具有靶向功能的還原敏感響應(yīng)遮蔽層引入基因載體體系，可以通過(guò)調(diào)節(jié)遮蔽比例(HA-SS-C00H/DNA)，控制過(guò)分遮蔽對(duì)轉(zhuǎn)染效率的降低，同時(shí)利用靶向配體提高基因載體對(duì)目標(biāo)組織的特異性識(shí)別和傳遞，并將運(yùn)載的DNA環(huán)境響應(yīng)地釋放在靶細(xì)胞內(nèi)。
4.所述基因載體的制備方法原料易于獲取，反應(yīng)也較為簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)參數(shù)和易控制。5.本發(fā)明所述基因載體，能夠很方便地用于體外基因轉(zhuǎn)染、腫瘤、哮喘和心血管疾病的基因治療


圖I本發(fā)明所述遮蔽體系的結(jié)構(gòu)和合成過(guò)程示意圖。圖2是PEI/DNA/HA-SS-C00H復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中從左至右共八條泳道，第一道為裸DNA ;第二道至第七道為PEI/DNA/HA-SS-C00H復(fù)合物，其中HA-SS-COOH/DNA的質(zhì)量比分別為10、6、3、2、1和O. 5時(shí)的電泳圖;第八道為PEI/DNA復(fù)合物。圖3是不同濃度的PEI/DNA/HA-SS-C00H復(fù)合物對(duì)B16細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的細(xì)胞
存活率。圖4 是 PEI/DNA 復(fù)合物和 PEI/DNA/HA-SS-COOH (HA-SS-COOH/DNA 質(zhì)量比為 I)復(fù)合物分別介導(dǎo)綠色熒光蛋白質(zhì)粒對(duì)B16細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。以下實(shí)施例中所用原料均為市售。實(shí)施例I :具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系的制備
按照表I所述的投料比例，將透明質(zhì)酸溶于pH 6. 8的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI-羥基苯并三唑(Η0ΒΤ)，攪拌，室
溫下反應(yīng)2小時(shí)活化羧基。加入胱胺二鹽酸鹽(Cys)，攪拌，上述反應(yīng)溶液在室溫下反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物用截留量為3500的透析袋透析48小時(shí)，凍干，得到胱胺接枝的透明質(zhì)酸(HA-Cys)。通過(guò)核磁圖譜計(jì)算產(chǎn)物(HA-Cys)中胱胺的接枝率,結(jié)果見表I。將不同比例胱胺接枝的透明質(zhì)酸(HA-Cys)溶于pH 8. 5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入5倍過(guò)量的二硫蘇糖醇(DTT)，在室溫下反應(yīng)4小時(shí)后，用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)pH值到3.5，然后加入氯化鈉(NaCl)至終濃度為5% (質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))。隨后，用乙醇沉淀，再?gòu)?fù)溶于水，離心，凍干即可得到巰基化的透明質(zhì)酸(HA-SH)。用Ellman方法(見Anal Biochem.1985;145:200-4.)計(jì)算產(chǎn)物(HA-SH)中SH所占的比例，結(jié)果見表I。不同比例巰基化的透明質(zhì)酸(HA-SH)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，與100倍過(guò)量的3-巰基丙酸在室溫下反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物用截留量為3500的透析袋透析48小時(shí)，凍干，得到二硫鍵修飾且末端為羧基的透明質(zhì)酸(HA-SS-C00H)。用Ellman方法計(jì)算產(chǎn)物(HA-SS-COOH)中S-S所占的比例，結(jié)果見表I。
表I具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系的制備表
權(quán)利要求
1.一種基因載體系統(tǒng)，由遮蔽體系、陽(yáng)離子高分子材料和質(zhì)粒DNA組成，所述陽(yáng)離子高分子材料和質(zhì)粒DNA復(fù)合形成復(fù)合物顆粒，所述遮蔽體系通過(guò)靜電作用遮蔽到復(fù)合物表面，其特征在于所述遮蔽體系為具有靶向功能和還原敏感特性的透明質(zhì)酸衍生物。
2.如權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于所述的陽(yáng)離子高分子材料為聚乙烯亞胺，聚賴氨酸，聚酰胺-胺等聚陽(yáng)離子或魚精蛋白中的任意一種。
3.如權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于所述的質(zhì)粒DNA采用在真核細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒DNA。
4.如權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于所述遮蔽體系與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比例為O. I 1-50 :1，陽(yáng)離子高分子材料與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比例為O. I :1_50 :1。
5.如權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于所述遮蔽體系是通過(guò)對(duì)透明質(zhì)酸上的至少一個(gè)葡萄糖醛酸單元上的羧基進(jìn)行修飾，得到的具有還原敏感的二硫鍵并且末端仍是羧基的透明質(zhì)酸衍生物。
6.如權(quán)利要求5所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于所述透明質(zhì)酸的分子量為5000-2000000 道爾頓。
7.—種如權(quán)利要求I中所述的基因載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，具體步驟如下 (1)具有祀向功能的還原敏感遮蔽體系的制備 1)將透明質(zhì)酸溶于pH6. 8的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入I- (3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)和I-羥基苯并三唑(HOBT)，攪拌，活化羧基；加入胱胺二鹽酸鹽(Cys)，攪拌，室溫下反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行透析，冷凍干燥，得到胱胺接枝的透明質(zhì)酸(HA-Cys)； 2)將胱胺接枝的透明質(zhì)酸(HA-Cys)溶于pH8. 5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入過(guò)量的二硫蘇糖醇(DTT)，在室溫下反應(yīng)4小時(shí)后，用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)pH值到3. 5，然后加入氯化鈉(NaCl)至其最終質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù)為5%，隨后，用乙醇沉淀，再?gòu)?fù)溶于水，離心，冷凍干燥即可得到巰基化的透明質(zhì)酸(HA-SH)； 3)巰基化的透明質(zhì)酸(HA-SH)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，與過(guò)量的3-巰基丙酸在室溫下反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行透析，冷凍干燥，得到二硫鍵修飾且末端為羧基的透明質(zhì)酸(HA-SS-COOH)； (2)具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系的基因載體系統(tǒng)的制備 將質(zhì)粒DNA溶于滅菌水中，獲得溶液A ;將陽(yáng)離子聚合物基因載體溶于HBG緩沖液中，得到溶液B ;將具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系(HA-SS-COOH)溶于HBG緩沖液中，得到溶液C ;A和B復(fù)合得到基因載體和質(zhì)粒DNA的復(fù)合物顆粒溶液，在室溫下放置20分鐘后，力口入溶液C，得到一種具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系的基因載體系統(tǒng)。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于步驟(I)中加入的透明質(zhì)酸(HA)和胱胺二鹽酸鹽的質(zhì)量比在1:30-30:1之間。
9.如權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，將其用于體外基因轉(zhuǎn)染、腫瘤、哮喘和心血管疾病的基因治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有靶向功能的還原敏感遮蔽體系的基因載體系統(tǒng)及其制備方法和在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。該基因載體系統(tǒng)由具備靶向功能的還原敏感遮蔽體系、陽(yáng)離子高分子材料和質(zhì)粒DNA組成；陽(yáng)離子高分子材料和質(zhì)粒DNA復(fù)合形成復(fù)合物顆粒，具有靶向功能的還原敏感遮蔽體系通過(guò)靜電作用遮蔽到復(fù)合物表面，可以降低載體的毒性，并成功將負(fù)載的基因物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因物質(zhì)的表達(dá)，完成轉(zhuǎn)染過(guò)程，并且可以提高基因轉(zhuǎn)染的靶向性，同時(shí)提高基因轉(zhuǎn)染效率。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102899343SQ20121038031
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者顧忠偉, 聶宇, 何一燕, 程剛, 謝麗 申請(qǐng)人:四川大學(xué)