一種產(chǎn)堿性纖維素酶的銅綠假單胞菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一株能夠產(chǎn)纖維素酶的銅綠假單胞菌菌株P(guān)KC-001。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2010294，保藏日期為2010年11月8日。據(jù)外觀形態(tài)、生化反應(yīng)和16S?rDNA序列分析鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)。本發(fā)明所提供的銅綠假單胞菌菌株具有如下特點：1、能夠產(chǎn)生纖維素酶；2、所產(chǎn)的纖維素酶在酸性和堿性條件下均具有CMC酶活力，酸性條件下的最適作用pH為5.0，堿性條件下的最適作用pH為8.6，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】一種產(chǎn)堿性纖維素酶的銅綠假單胞菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和工程領(lǐng)域，特別涉及從自然界中纖維素豐富的環(huán)境中篩選、分離、純化到一株能產(chǎn)生纖維素酶的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
技術(shù)背景
[0002]由植物(包括光合自養(yǎng)微生物)通過光合作用形成的有機(jī)碳化合物，除成型木材外，統(tǒng)稱為植物生物質(zhì)(biomass)。木質(zhì)纖維(Iignocellulose)是構(gòu)成植物生物質(zhì)的主要成分，也是目前公認(rèn)的地球上資源量最大的可再生有機(jī)化合物資源，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大類組分構(gòu)成，同時還可能含有少量的果膠、幾丁質(zhì)、硅酸鹽等成分。纖維素是木質(zhì)纖維中含量最高的組分，通常占總重量的35-45%，為一類由葡萄糖分子通過β-1，4糖苷鍵連接形成的線狀多聚葡萄糖。這一結(jié)構(gòu)與通過α -1，4糖苷鍵連接形成葡聚糖分子的淀粉類物質(zhì)不同，因此不受淀粉水解酶類的水解。
[0003]不過，由于纖維素的構(gòu)成單元為葡萄糖，挖掘在溫和條件下將其水解的生物酶制劑，無論是對該資源的開發(fā)，還是對纖維素加工產(chǎn)業(yè)(紡織、造紙等)的技術(shù)改進(jìn)，都具有重要的意義。經(jīng)多年的研究發(fā)現(xiàn)，按作用的最適PH條件劃分，纖維素水解酶通?？煞譃樗嵝岳w維素酶和堿性纖維素酶。
[0004]酸性纖維素酶指作用的最佳pH條件在酸性范圍的一類纖維素水解酶，目前發(fā)現(xiàn)的主要由一些絲狀真菌，如木霉、根霉等微生物產(chǎn)生，通常含有三種酶活力組分:1、內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase),即內(nèi)切 _β-1,4 葡聚糖酶(endo-β -1,4-glucanase, EC3.2.1.4)，簡稱內(nèi)切酶(EG或BGL) ;2、外切葡聚糖酶，包括兩類酶，一是i3-l，4_D-葡萄糖-葡萄糖水解酶(EC 3.2.1.74)，也稱纖維糊精酶。二是β-1，4-?-葡聚糖-纖維二糖水解酶，又稱外切-β -1，4-葡聚糖酶(exo-β -1,4-glucanase, EC 3.2.1.91)或纖維二糖水解酶(cellobiohydrola se，CBH)，簡稱外切酶；3、β_1，4_葡萄糖苷酶(β_1，4-glucosidase, EC3.2.1.21)或β -葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，簡稱葡萄糖苷酶(β -glucosidase, β _G)或纖維二糖酶(cellobiase, CB)等。這類纖維素酶通常能夠?qū)⒗w維素完全水解成游離的葡萄糖分子，因此也稱為纖維素水解完全酶，現(xiàn)主要用于纖維素資源開發(fā)研究、飼料工業(yè)，以及紡織工業(yè)對棉料的表面處理。
[0005]堿性纖維素酶則指在堿性條件下能夠催化裂解纖維素分子的一類水解酶，最早在上世紀(jì)70年代由日本科學(xué)家在嗜堿性的芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)。目前的研究表明，該類纖維素酶一般只有纖維素內(nèi)切酶，即內(nèi)切_ β _1，4葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase,EC 3.2.1.4,簡稱內(nèi)切酶，EG或BGL)的活性，活力用羧甲基纖維素(CMC)為底物測定，因此，也稱為羧甲基纖維素酶(CMCase)。其活性通常以CMC活性單位表示。由于堿性纖維素酶的作用pH在堿性范圍內(nèi)，與紡織物洗滌條件比較一致，能夠在溫和條件下作用于污潰附著的位點，卻不會對衣物造成損害，所以，該酶類產(chǎn)品目前主要用于洗滌工業(yè)，為加酶洗滌產(chǎn)品的必需原料。至今為止，能夠產(chǎn)生堿性纖維素酶的微生物多為細(xì)菌菌株，包括芽孢梭菌屬、纖維單胞菌屬、纖維弧菌屬、混合纖維弧菌、芽孢桿菌屬等的一些菌種，以及牛黃瘤胃梭菌、白色瘤胃球菌、溶纖維菌，熱纖梭菌、解纖維梭菌、糞堿纖維單胞菌等菌種，國外該類酶的工業(yè)化生產(chǎn)主要以芽孢桿菌屬的菌株(如Bacillus sp.KSM-635)為發(fā)酵菌種。國內(nèi)的研究受制于缺乏堿性纖維素酶的高產(chǎn)菌株，鮮有大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，挖掘新的微生物產(chǎn)纖維素酶菌株仍極為必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一株產(chǎn)生纖維素酶的微生物新菌株，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PKC-001。該菌株所產(chǎn)生的纖維素酶既有酸性纖維素酶的活力，也有堿性纖維素酶的活力，是一種新型的纖維素酶產(chǎn)酶菌株。該菌株是發(fā)明人用微生物學(xué)手段從造紙廠的廢棄紙漿中分離選育得到，已于2010年11月8日保藏于位于中國武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No:M2010294。
[0007]該菌株為短桿狀，1.5 μ mX 0.5 μ m，單生鞭毛，運動活躍。在平板培養(yǎng)基上顯示為扁平、邊緣鋸齒的圓形菌落，色澤光亮。
[0008]該菌株的最佳生長條件為:最適培養(yǎng)溫度為37°C，高至42°C還可以生長；最適PH8.0,在7.5-12的堿性范圍內(nèi)均可生長，而在酸性條件下生長極慢。液體培養(yǎng)時接種量5%，轉(zhuǎn)速為200rpm。培養(yǎng)8h左右進(jìn)入對數(shù)期，32h后進(jìn)入衰退期。
[0009]生化鑒定結(jié)果為:革蘭氏染色陰性，凝膠液化陽性，綠膿菌素陽性。
[0010]該菌株具有表1所示的16s rDNA序列。序列分析顯示該株與銅綠假單胞菌具有99%的同源性。
[0011 ] 該菌株能夠產(chǎn)生在酸性和堿性條件下均具有CMC活力的纖維素水解酶。所產(chǎn)酶的最適PH在酸性條件下為5.0，在堿性條件下8.6。
[0012]該菌株的最大產(chǎn)纖維素水解酶發(fā)酵時間是37°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)約60h。
[0013]本發(fā)明的特點和技術(shù)進(jìn)步
[0014]1.新的纖維素酶產(chǎn)酶菌株
[0015]本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)和證實了銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌株能夠產(chǎn)生纖維素水解酶，這至今未見報道。
[0016]2.菌株能產(chǎn)生在酸性和堿性條件下均有活力的纖維素酶
[0017]至今所報道的微生物菌株大多只能產(chǎn)生酸性或堿性纖維素酶，本發(fā)明所提供的菌株能夠產(chǎn)生在酸性和堿性條件下均具有活力的纖維素酶，對此至今尚未見報道。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]附圖1:CCTCC No:M2010294銅綠假單胞菌PKC-001菌株的生長曲線。注培養(yǎng)基含蛋白胨 5g/L，酵母抽提物 5g/ L，NaCl 5g/L，KH2PO4 lg/L，MgSO4.7H20 2g/L，121°C滅菌20min，用預(yù)先滅菌的10% (W/V)Na2CO3溶液調(diào)pH至8.0~9.0。培養(yǎng)條件:37°C，200rpm
搖瓶培養(yǎng)；
[0019]附圖2 =CCTCC No:M2010294銅綠假單胞菌PKC-001菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適作用pH。菌株用培養(yǎng)基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L,KH2PO4 lg/L,MgSO4.7Η202g/L，121°C滅菌 20min，用預(yù)先滅菌的 10% (W/V)Na2CO3 溶液調(diào) pH 至 8.0 ~9.0)在 37。。，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)64小時，接種量5%，然后取發(fā)酵菌液按QB2583-2003的方法測定纖維素酶的CMC活力。測定溫度為42°C。以Imin水解CMC-Na底物產(chǎn)生Iumol的葡萄糖殘基為I個酶活單位；
[0020]附圖3 =CCTCC No:M2010294銅綠假單胞菌PKC-OOl菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適作用溫度。菌株用培養(yǎng)基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 lg/L,MgSO4.7H20 2g/L, 121°C滅菌 20min，用預(yù)先滅菌的 10% (ff/V)Na2CO3 溶液調(diào) pH 至 8.0 ~9.0)在37°C，200rpm下培養(yǎng)64小時，接種量5%，取發(fā)酵菌液測定不同溫度下的CMC酶活力和蛋白質(zhì)含量。CMC酶活力按QB2583-2003的方法測定，pH為8.5，蛋白質(zhì)含量用Braford方法測定，以Imin水解CMC-Na底物產(chǎn)生Iumol的葡萄糖殘基為I個酶活單位；
[0021]附圖4 =CCTCC No:M2010294銅綠假單胞菌PKC-OOl菌株所產(chǎn)纖維素酶的時間曲線。注:菌株用培養(yǎng)基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 lg/L,MgSO4.7H20 2g/L, 121°C滅菌 20min，用預(yù)先滅菌的 10% (ff/V)Na2CO3 溶液調(diào) pH 至 8.0 ~9.0)在37°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)，接種量5 %，定時取發(fā)酵菌液測定纖維素酶活力和蛋白含量。CMC酶活力按QB2583-2003的方法測定，pH為8.5，蛋白質(zhì)含量用Braford方法測定，以Imin水解CMC-Na底物產(chǎn)生Iumol的葡萄糖殘基為I個酶活單位；
[0022]附圖5 =CCTCC No:M2010294銅綠假單胞菌PKC-OOl菌株對外分泌蛋白的時間曲線。注:菌株用培養(yǎng)基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 lg/L,MgSO4.7H20 2g/L, 121°C滅菌 20min，用預(yù)先滅菌的 10% (ff/V)Na2CO3 溶液調(diào) pH 至 8.0 ~
9.0)在37°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)，接種量5%，定時取發(fā)酵菌液用Braford方法測定蛋白含量。
【具體實施方式】
[0023]1、菌株分離選育過程
[0024]分三步進(jìn)行,采樣、初篩、復(fù)篩和純化。
[0025]1.1 采樣
[0026]從廣西壯族自治區(qū)南寧市的造紙廠采集廢棄紙漿；
[0027]1.2 初篩
[0028] 從采集的廢紙漿中隨機(jī)抽取約Ig樣品，浮于IOml無菌水中，充分振搖，靜止30分鐘，讓殘渣下沉，取上清液稀釋IO5倍，涂布接種瓊脂平板初篩培養(yǎng)基(含蛋白胨10g/L，酵母抽提物 5g/L，NaCl 5g/L, KH2PO4 lg/L，MgSO4.7Η20 lg/L, CMC-Na 10g/L，剛果紅 0.03g/L，瓊脂粉20g/L, 121°C滅菌20min，用預(yù)先滅菌的10% (ff/V)Na2CO3溶液調(diào)pH至8.0~9.0)，37°C培養(yǎng)72h。挑取透明水解圈較大的菌落作進(jìn)一步篩選。
[0029]1.3復(fù)篩和純化
[0030]將初篩得到的菌落劃線接種瓊脂平板復(fù)篩培養(yǎng)基(除蛋白胨含量減少為5g/L，MgSO4.7H20的含量增加為2g/L外，其余與上述初篩培養(yǎng)基相同)，37°C培養(yǎng)72h，挑選透明水解圈大且清晰、穩(wěn)定的菌株，反復(fù)劃線接種純化5次。然后挑單菌落接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基(同復(fù)篩培養(yǎng)基，不加剛果紅和瓊脂)，于37°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)24h，取發(fā)酵液測定堿性纖維素酶的活力，篩選得到I株產(chǎn)堿性纖維素酶的高產(chǎn)菌株，命名為PKC-001。
[0031]2、菌株的分類鑒定
[0032]2.1形態(tài)鑒定[0033]將篩選得到的PKC-001菌株接種液體菌株培養(yǎng)基(同上述液體復(fù)篩培養(yǎng)基，不加CMC-Na和剛果紅)，37°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)16h，顯微鏡下觀察菌體的外觀特征，用測微尺測量菌體細(xì)胞的大小。顯示菌體細(xì)胞為短桿狀，大小1.5 μ mX0.5 μ m,單生鞭毛,運動活躍。此外，菌體在篩選平板培養(yǎng)基上顯示為扁平、邊緣鋸齒的圓形菌落，色澤光亮。
[0034]2.1生化鑒定
[0035]參照國標(biāo)GB7918.4-1987，對PKC-OOl菌株進(jìn)行凝膠化反應(yīng)和綠膿菌素檢驗。
[0036]I)凝膠化檢測:先將篩選得到的PKC-OOl菌株用上述液體菌株培養(yǎng)基在37°C，200rpm下培養(yǎng)16h，再轉(zhuǎn)接一次，得到活化菌株。然后按國標(biāo)GB7918.4-1987的方法取菌株培液穿刺接種明膠培養(yǎng)基(含牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，明膠120g/L，加熱溶解，調(diào)pH至
7.4，115°C滅菌20min，分裝制成高層培養(yǎng)基)，37°C下培養(yǎng)24h，取出放入冰箱內(nèi)30min。結(jié)果呈陽性反應(yīng)，培養(yǎng)基被液化；
[0037]2)綠膿菌素檢測:篩選得到的PKC-OOl菌株按上述活化，接種綠膿菌素檢測培養(yǎng)基[含蛋白胨20g/L，氯化鎂1.4g/L，硫酸鉀10g/L，瓊脂18g/L，甘油(化學(xué)純)10g/L，加熱溶解，調(diào)pH至7.4，115°C滅菌20min,制成斜面]，37°C培養(yǎng)24小時，向培養(yǎng)物加入3~5ml氯仿，待氯仿呈藍(lán)色時，將氯仿轉(zhuǎn)移到另一試管，加入Iml濃度為IN的鹽酸，振搖2min。結(jié)果上層鹽酸呈紅紫色，表明反應(yīng)呈陽性。
[0038]2.3分子鑒定
[0039]將PKC-001菌株同上活化后接種液態(tài)菌株培養(yǎng)基(同上)，接種量5%，37°C，200rpm下培養(yǎng)16h至對數(shù)期，菌株達(dá)到2X 108/ml以上。取培養(yǎng)液2ml，15000rpmX IOmin離心，棄上清，菌體用無菌 蒸餾水洗滌2次，收集菌體細(xì)胞，用液氮冷凍研磨破碎，用酚-氯仿法提取菌體的基因組DNA。以該DNA為模板，采用通用引物:BSF8/20:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(正向);BSR1492/21:ACGGCTACCTTGTTACGACTT (反向)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增菌體的16SrDNA序列，50ul的反應(yīng)體系含PCR緩沖液5ul，正、反向引物各 IuM, Mg2+2.5mM，各 dNTP0.02mM, TaqDNA 聚合酶 1.25U。反應(yīng)條件為:95°C,5min ；94。。，30s ；55°C, 30s ；72°C, lmin, 30cycles ;最后 72°C, IOmin0 反應(yīng)完成后，瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離 PCR 產(chǎn)物，使用 TaKaRa AgaroseGel DNA Purification Kit Ver.2.0 (CodeN0.DV805A)試劑盒切膠回收擴(kuò)增的目的片段，將目的片段連接到PMD-18T載體，將帶有目的片段的PMD-18T載體通過轉(zhuǎn)化E.coli DH5a菌株進(jìn)行擴(kuò)增后，測定載體上目的片段的序列，得到該菌株1501bp的16S rDNA序列。將序列在NCBI網(wǎng)站的Genbank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列比對搜索(Nucleitide-NucleitideBLAST)，結(jié)果表明，該菌株16SrDNA與Pseudomonas aeruginosa strain DQl 菌株的 16s rDNA 序列(GU269267.1), Pseudomonasaeruginosa strain AS2 菌株的 l6s rDNA 序列(GU447228.I)具有的序列同源性(PKC-001的16SrDNA序列見附表)。
[0040]綜合上述結(jié)果，鑒定所選育得到的產(chǎn)纖維素酶菌株P(guān)KC-001為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。
[0041]3、菌株及其所產(chǎn)纖維素酶的特性
[0042]3.1菌株的生長特性
[0043]將PKC-001菌株接種液態(tài)菌株培養(yǎng)基(同上)，接種量5%，在不同條件下觀察菌株的生長情況。結(jié)果表明，菌株的最適培養(yǎng)溫度為37°C，高至42°C還可以生長；生長最適pH為8.0，在pH7.5-12的堿性范圍內(nèi)均可生長，而在酸性條件下生長極慢。200rpm搖床培養(yǎng)時，37°C下培養(yǎng)8h左右進(jìn)入對數(shù)期，32h后進(jìn)入衰退期(附圖1)。
[0044]3.2菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適作用pH
[0045]將PKC-001菌株按上述方法活化后接種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(同上述復(fù)篩培養(yǎng)基，不加剛果紅和瓊脂成分)，接種量5%，在37°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)64h，取菌液12000rpm離心lOmin，取上清在pH為6、7、8、8.5、9、10、11、12、13的緩沖條件下測定纖維素酶的活力，反應(yīng)溫度42°C，以Imin水解CMC-Na底物產(chǎn)生Iumol的葡萄糖殘基為I個酶活單位。結(jié)果表明=PKC-OOl菌株所產(chǎn)的纖維素酶在酸性和堿性條件下均具有活力。酸性纖維素酶的最適pH為5.0，在pH4-6的范圍內(nèi)顯示酶活力。堿性纖維素酶活力的最適pH為8.6，在pH7-ll的范圍內(nèi)保持部分酶活(附圖2)。
[0046]3.3菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適作用溫度
[0047]同上將將PKC-OOl菌株接種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(同上)，接種量5%，在37°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)64h，取菌液12000rpm離心lOmin，在pH8.6的條件下，以CMC-Na為底物，按國標(biāo)GB (2583-2005)的方法測定菌株所產(chǎn)堿性纖維素酶在30、35、40、47.5、50、55、60°C的活性，結(jié)果表明在50°C下酶活力最高，反應(yīng)溫度從30°C上升至50°C，酶活力逐步上升，溫度超過50°C后，酶活力迅速下降，溫度為60°C的酶活力只有最高酶活的0.6% (附圖3)。
[0048]3.4菌株的產(chǎn)酶時間
[0049]將PKC-OOl菌株同上活化后接種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(同上述復(fù)篩培養(yǎng)基，不加剛果紅和瓊脂)，接種量5%，于37°C下200rpm搖瓶培養(yǎng)，按國標(biāo)QB2583-2003的方法，以CMC-Na為底物，在PH8.5的條件下 測定 發(fā)酵液的CMC酶活力，觀察菌株的產(chǎn)酶情況，用Braford方法測定發(fā)酵液的蛋白濃度，觀察 菌株向外分泌蛋白的情況，結(jié)果表明該菌株在培養(yǎng)啟動時即開始對外分泌蛋白，培養(yǎng)24h蛋白產(chǎn)量達(dá)到最高，此后發(fā)酵液的蛋白濃度基本保持不變。產(chǎn)酶方面，培養(yǎng)IOh,菌株進(jìn)入對數(shù)期后開始產(chǎn)生纖維素酶,培養(yǎng)24h后大量產(chǎn)酶,在培養(yǎng)66h發(fā)酵液的堿性纖維素酶活力達(dá)到最大值，隨后迅速降低，培養(yǎng)到IOOh發(fā)酵液的酶活幾乎為零(附圖4、5)。
【權(quán)利要求】
1.一種能產(chǎn)纖維素酶的微生物菌株，分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),菌株號:PCK_001,真空冷凍保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號:CCTCCNo:M2010294，保藏日期:2010 年 11 月 8 日。
2.權(quán)利要求1所述的能產(chǎn)纖維素酶的銅綠假單胞菌菌株，其特征為具有銅綠假單胞菌的典型特征，菌體細(xì)胞為短桿狀，大小1.5 μ mX 0.5 μ m，單生鞭毛，運動活躍，菌體在瓊脂平板培養(yǎng)基上顯示為扁平、邊緣鋸齒的圓形菌落，色澤光亮。其16srDNA序列具有所附序列所不的 1501bp 序列，Genbank 核酸數(shù)據(jù)庫所列的 Pseudomonas aeruginosa strain DQl 菌株的 16s rDNA 序列(GU269267.1), Pseudomonas aeruginosa strain AS2 菌株的 16s rDNA序列(⑶447228.1)具有99%的序列同源性。
3.權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌菌株，其特征在于最大產(chǎn)纖維素水解酶發(fā)酵條件是37 0C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)約60h。
4.權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于所發(fā)酵產(chǎn)生的堿性纖維素酶，最適反應(yīng)溫度為50°C，在30°C -55°C范圍內(nèi)保持35%以上的酶活。
5.權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌菌株，其特征在于能夠產(chǎn)生在酸性和堿性條件下均具有CMC活力的纖維 素水解酶。所產(chǎn)酶的最適pH在酸性條件下為5.0，在堿性條件下為8_ 6。
【文檔編號】C12N9/42GK103468597SQ201210382171
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月11日
【發(fā)明者】蘆志龍, 陳東, 張穗生, 陸琦, 黃日波 申請人:廣西科學(xué)院