一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法，所述方法包括：（1）精液采集，（2）抗凍液選擇，（3）精子的稀釋與平衡，（4）精子的冷凍，（5）精子的解凍與復(fù)蘇。本發(fā)明具有操作時(shí)間短、誘導(dǎo)效果好、毒性作用少、損傷程度小、成活率高等優(yōu)點(diǎn)，其在大口黑鱸的種質(zhì)保存、遺傳育種、可持續(xù)養(yǎng)殖及病害防治等方面有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明還提供一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法的用途。
【專利說(shuō)明】一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及精子冷凍【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種大口黑鱸精子的冷凍保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)是一個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，在常規(guī)養(yǎng)殖品種迅猛發(fā)展之后，特種水產(chǎn)品的養(yǎng)殖得到快速發(fā)展。大口黑鱸具有生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、病害少、容易捕撈等諸多優(yōu)點(diǎn)，其肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，頗受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者歡迎。自上世紀(jì)80年代引種以來(lái)，已經(jīng)在廣東、浙江和江蘇形成了較大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)。但是因引進(jìn)時(shí)由野生種家養(yǎng)馴化而成，缺少定向選育，隨著時(shí)間推移，大口黑鱸出現(xiàn)了不同程度的種質(zhì)退化，主要表現(xiàn)在性成熟年齡提前、生長(zhǎng)速度下降、抵抗疾病能力下降，開(kāi)展大口黑鱸選育工作，選育生長(zhǎng)速度快、品質(zhì)優(yōu)良的品系已勢(shì)在必行。因此，對(duì)其進(jìn)行精子冷凍保存技術(shù)的研究對(duì)于大口黑鱸種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種能高效、長(zhǎng)期保存大口黑鱸精子的超低溫冷凍及復(fù)蘇方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法，所述方法包括:(1)精液采集，(2)抗凍液選擇，(3)精子的稀釋與平衡，(4)精子的冷凍，(5)精子的解凍與復(fù)蘇；
(1)精液采集:選擇形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好、無(wú)疾病、達(dá)到性成熟的大口黑鱸個(gè)體，在大口黑鱸繁殖期按800UI/kg胸鰭注射進(jìn)行誘導(dǎo)促熟，36h后收集精液于4°C冰箱中預(yù)冷的干凈研缽中；
(2)抗凍液選擇:以任氏液為基礎(chǔ)，加10%甲醇抗凍保護(hù)劑；
(3)精子的稀釋與平衡:精液與任氏液按1:6稀釋后，經(jīng)4°C平衡30min，加入10%甲醇，混勻，分裝；
(4)精子的冷凍:分裝好的精液在液氮面上方6cm處平衡IOmin,在液氮面上平衡5min后投入液氣中保存；
(5)精子的解凍與復(fù)蘇:將凍存管在液氮蒸汽中平衡5分鐘，迅速置于37°C水浴鍋中快速晃動(dòng)至融化。
[0005]本發(fā)明還提供一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法的用途，以所述大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法保存的精子用于進(jìn)行人工授精:將大口黑鱸魚(yú)卵擠入容器中，按IO5:1的精卵數(shù)量比例滴加入解凍后的精液，拌勻，再滴加適量激活液(10 mMTrfs, 20 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH=8.5)，拌勻，使卵受精。
[0006]優(yōu)選的，所述激活液由10 mM Trfs,20 mM NaCl和2 mM CaCl2配成，配好后的激活液 pH=8.5。
[0007]本發(fā)明具有操作時(shí)間短、誘導(dǎo)效果好、毒性作用少、損傷程度小、授精率高等優(yōu)點(diǎn)，其在大口黑鱸的種質(zhì)保存、遺傳育種、可持續(xù)養(yǎng)殖及病害防治等方面有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附后權(quán)利要求書(shū)限定的范圍。
[0009]實(shí)施例1，
親魚(yú)的選擇:形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好、無(wú)疾病、達(dá)到性成熟的原種或良種。
[0010]精子的采集:在大口黑鱸繁殖期按800UI/kg腹腔注射進(jìn)行誘導(dǎo)增精，36h后，收集精液于4°C冰箱中預(yù)冷的干凈研缽中。
[0011]鮮精活力檢測(cè):先用細(xì)口吸管吸一滴水于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下邊攪勻邊觀察其活力。
[0012]冷凍方法:將精液與任氏液按1:6稀釋后，經(jīng)4°C平衡30min，加入10%甲醇混勻，分裝，在液氮面上方6cm處平衡lOmin，在液氮面上平衡5min后投入液氮中保存。
[0013]解凍方法:將凍存管在液氮蒸汽中平衡5分鐘，迅速置于37°C水浴鍋中快速晃動(dòng)至融化。
[0014]凍精活力檢測(cè):先用細(xì)口吸管吸一滴激活液于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下邊攪勻邊觀察其活力。
[0015]本發(fā)明具有操作時(shí)間短、誘導(dǎo)效果好、毒性作用少、損傷程度小、成活率高等優(yōu)點(diǎn)。其在大口黑鱸的種質(zhì)保存、遺傳育種、可持續(xù)養(yǎng)殖及病害防治等方面有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0016]以上為對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的描述，通過(guò)對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的上述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法，其特征在于，所述方法包括:(1)精液采集，(2)抗凍液選擇，(3)精子的稀釋與平衡，(4)精子的冷凍，(5)精子的解凍與復(fù)蘇； 精液采集:選擇形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好、無(wú)疾病、達(dá)到性成熟的大口黑鱸個(gè)體，在大口黑鱸繁殖期按800UI/kg胸鰭注射進(jìn)行誘導(dǎo)促熟，36h后收集精液于4°C冰箱中預(yù)冷的干凈研缽中； 抗凍液選擇:以任氏液為基礎(chǔ)，加10%甲醇抗凍保護(hù)劑； 精子的稀釋與平衡:精液與任氏液按1:6稀釋后，經(jīng)4°C平衡30min，加入10%甲醇，混勻，分裝； 精子的冷凍:分裝好的精液在液氮面上方6cm處平衡IOmin,在液氮面上平衡5min后投入液氣中保存； 精子的解凍與復(fù)蘇:將凍存管在液氮蒸汽中平衡5分鐘，迅速置于37°C水浴鍋中快速晃動(dòng)至融化。
2.一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法的用途，其特征在于，以所述大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法保存的精子用于進(jìn)行人工授精:將大口黑鱸魚(yú)卵擠入容器中，按105:1的精卵數(shù)量比例滴加入解凍后的精液，拌勻，再滴加適量激活液，拌勻，使卵受精。
3.如權(quán)利要求2所述的大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法的用途，其特征在于，所述激活液由10 mM Trfs,20 mM NaCl和2 mM CaCl2配成，配好后的激活液pH=8.5。
【文檔編號(hào)】C12N5/076GK103719071SQ201210382548
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月11日
【發(fā)明者】徐海華, 王榮泉, 宣云峰 申請(qǐng)人:吳江市長(zhǎng)漾漁業(yè)生態(tài)科技發(fā)展有限公司