一種b族鏈球菌(gbs)核酸檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種B族鏈球菌(GBS)核酸檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒含有：單引物等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)酶（SPIA）：BstDNA聚合酶，RNaseH；SPIA反應(yīng)液：dNTPs，引物，Bst酶Buffer，RNaseHBuffer；RIDA反應(yīng)體系：切刻內(nèi)切酶選擇Nb.BtsI及探針；SSPIA反應(yīng)引物：P1．5'-3'UCGAUCAUGTTAGCCGC、5'端后八個(gè)堿基是RNA其余堿基是DNA，RIDA探針:5'-3’GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT，內(nèi)質(zhì)控SPIA引物：P2.5'-3'CUGUCGAUCGCAATCGG、5'端后八個(gè)堿基是RNA其余堿基是DNA，內(nèi)質(zhì)控RIDA探針：5'-3'GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC，內(nèi)質(zhì)控為插入了人GAPDH基因的質(zhì)粒DNA。本發(fā)明采用SPIA與RIDA技術(shù)相結(jié)合的方法檢測B族鏈球菌(GBS)核酸序列的方法，具有靈敏，特異，快速的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】—種B族鏈球菌(GBS)核酸檢測試劑盒及檢測方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種B族鏈球菌(GBS)的核酸檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]B族鏈球菌為兼性厭氧的革蘭氏陽性鏈球菌，正常婦女帶菌率達(dá)30%左右，屬于條件致病菌，孕婦感染可通過產(chǎn)道傳播給新生兒，引起新生兒的敗血癥、腦膜炎、肺炎等，死亡率極高，是目前引發(fā)新生兒感染最主要的致病菌之一。本研究計(jì)劃用于檢測生殖道和直腸分泌物樣品中的B族鏈球菌DNA，可用于B族鏈球菌感染的輔助診斷及療效監(jiān)控。該項(xiàng)檢測的適用人群為妊娠34-37周的孕婦。B族鏈球菌感染的特異性常用診斷方法有兩種，即細(xì)菌分離鑒定以及分子生物學(xué)技術(shù)。細(xì)菌的分離培養(yǎng)繁雜費(fèi)時(shí)，無法滿足大量樣本的快速診斷。近年來分子生物學(xué)技術(shù)尤其以核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)發(fā)展迅猛。傳統(tǒng)PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在檢測B族鏈球菌核酸時(shí)一方面操作耗時(shí)，另一方面大量擴(kuò)增產(chǎn)物DNA容易造成交叉污染，引起后續(xù)試驗(yàn)的假陽性，此外傳統(tǒng)PCR技術(shù)對儀器要求比較高，不易在基層醫(yī)院進(jìn)行推廣。本試劑盒首次將單引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIA)與等溫信號方法技術(shù)(RIDA)兩種核酸檢測技術(shù)進(jìn)行了結(jié)合，兩種技術(shù)結(jié)合的優(yōu)勢如下:
第一，單純的擴(kuò)增反應(yīng)通過產(chǎn)生大量的核酸產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的檢測，該模式容易產(chǎn)生污染，而新方法通過擴(kuò)增結(jié)合信號放大的模式來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的檢測，第一步擴(kuò)增的過程可以控制在很短的時(shí)間內(nèi)，使產(chǎn)物的量控制在一定范圍之內(nèi)，然后通過后續(xù)的信號放大系統(tǒng)來判定結(jié)果。同時(shí)由于SPIA擴(kuò)增產(chǎn)物3’端被RNase H切割后缺失部分序列因而不會(huì)作為擴(kuò)增模板污染后續(xù)反應(yīng)，所以假陽性大大降低。
[0003]第二，通過在RIDA技術(shù)之前引入SPIA增強(qiáng)了 RIDA的靈敏度，同時(shí)兩種方法的結(jié)合相對于單純的擴(kuò)增反應(yīng)特異性有了很大提高，即使第一步出現(xiàn)非特異擴(kuò)增也可以通過第二步信號放大加以糾正。再通過對反應(yīng)時(shí)間的控制(減少第二步反應(yīng)時(shí)間)可以使得第二步反應(yīng)即使單獨(dú)出現(xiàn)非特異也不會(huì)有信號顯示從而也最大程度的降低了第二步反應(yīng)出現(xiàn)非特異的可能性。由于兩步同時(shí)出現(xiàn)非特異的可能性非常小，特別是由于第一步擴(kuò)增產(chǎn)物片段較小，針對擴(kuò)增產(chǎn)物的信號放大幾乎不可能出現(xiàn)非特異結(jié)果。所以這兩種方法的結(jié)合是一種互補(bǔ)，既提高了靈敏度也增強(qiáng)了特異性。
[0004]第三，整個(gè)反應(yīng)可以只需一個(gè)水浴鍋和一個(gè)簡易熒光檢測器即可實(shí)現(xiàn)對結(jié)果的判定，有利于在基層醫(yī)療檢疫機(jī)構(gòu)推廣。相比現(xiàn)有的PCR方法，其具有靈敏度高，反應(yīng)時(shí)間短，不依賴特殊儀器等優(yōu)勢，可以實(shí)現(xiàn)病原微生物的篩選及快速診斷，便于在基層醫(yī)院的推廣。我們建立了這一技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對病原微生物簡便，靈敏，特異，高通量的篩選鑒定。
[0005]第四，新方法在反應(yīng)體系中加入了內(nèi)質(zhì)控基因，內(nèi)質(zhì)控基因參與樣本的DNA提取過程，從而使得結(jié)果的判定更加準(zhǔn)確。
[0006]綜上所述，本試劑盒具有靈敏，特異，簡便，快捷，高效，不依賴特殊儀器等優(yōu)勢，可以實(shí)現(xiàn)對B族鏈球菌DNA的篩選及快速診斷，便于在基層醫(yī)院的推廣。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種利用SPIA與RIDA相結(jié)合的技術(shù)并具有特異，靈敏，快速，簡便，高效的B族鏈球菌DNA核酸檢測試劑盒及檢測方法。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:提供一種B族鏈球菌DNA核酸檢測試劑盒，該試劑盒含有:
(1)SPIA 反應(yīng)酶:Bst DNA 聚合酶；RNase H ；
(2)SPIA 反應(yīng)液:dNTPs，引物，Bst 酶 Buffer, RNase H Buffer ；
(3)RIDA反應(yīng)體系:切刻內(nèi)切酶選擇Nb.BtsI
SPIA反應(yīng)引物:Pl.5’-3’UCGAUCAUGTTAGCCGC 5’端后八個(gè)堿基是RNA其余堿基是
DNA
RIDA 探針:5’-3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT
內(nèi)質(zhì)控SPIA引物P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG 5’端后八個(gè)堿基是RNA其余堿基是DNA
內(nèi)質(zhì)控 RIDA 探針:5’ -3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC
內(nèi)質(zhì)控為插入了人GAPDH基因的質(zhì)粒DNA，內(nèi)質(zhì)控同被檢測樣本同時(shí)參與DNA提取過程。
[0009](4 )空白對照為DEPC水
(5)陰性對照為甲型溶血性(草綠色)鏈球菌DNA，大腸桿菌DNA
(6)陽性對照為B族鏈球菌(GBS)DNA。
[0010]該試劑盒，其檢測探針5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)為FAM，3'端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA。內(nèi)質(zhì)控探針Y端標(biāo)記熒光基團(tuán)為TET，3 ^端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA。
[0011]采用上述試劑盒檢測B族鏈球菌(GBS)核酸的檢測方法，包括以下步驟:
(I)DNA提取:DNA提取采用TAKARA細(xì)菌核酸提取專用試劑盒，提取方法參照說明書
進(jìn)行。提取到的核酸樣本利用紫外分光光度計(jì)測量濃度，經(jīng)過換算得到每微升拷貝數(shù)。內(nèi)質(zhì)控同被檢測樣本同時(shí)參與DNA提取過程。
[0012](2)引物設(shè)計(jì):從Genebank下載核酸序列，選擇B族鏈球菌(GBS)保守基因(CAMP),設(shè)計(jì)合成SPIA引物，引物的5’端后八個(gè)堿基是RNA其余堿基是DNA。
[0013]Pl: 5，-3，UCGAUCAUGTTAGCCGC
RIDA探針:根據(jù)前一步SPIA擴(kuò)增后的單鏈靶序列設(shè)計(jì)，探針序列:5’ -3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT, 5 '端標(biāo)記熒光基團(tuán)為FAM，3 '端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA。探針序列下劃線部分為切刻內(nèi)切酶N.BstNBI對應(yīng)的識別位點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)控為插入了人GAPDH基因的質(zhì)粒DNA。內(nèi)質(zhì)控SPIA引物P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG，5’端后八個(gè)堿基是RNA其余堿基是DNA。
[0014]內(nèi)質(zhì)控RIDA 探針:5’ _3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5 '端標(biāo)記熒光基團(tuán)為TET，3'端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA。
[0015]弓丨物和探針由TAKARA公司合成。
[0016](3)反應(yīng)體系:在 15yLSPIA 混和物(包含 Immo I/L dNTPs, 0.5 μ mol/L 反應(yīng)引物，0.5ymol/L 內(nèi)質(zhì)控引物，I μ IRNase H Buffer, 0.08U RNase H, 2U Bst DNA 聚合酶，1μ I Bst DNA聚合酶Buffer)中加入I μ L包含檢測標(biāo)本和內(nèi)質(zhì)控的DNA，混勻后在水浴鍋上60°C加熱30min，反應(yīng)結(jié)束后再加入I μ L 50pmol/L反應(yīng)探針及內(nèi)質(zhì)控探針，2 μ LNEB buffer3，5UN.BstNBI酶(NEB公司)?？偡磻?yīng)體積達(dá)到20 μ L。在水浴鍋上55°C繼續(xù)反應(yīng)15min后取出反應(yīng)管放置在紫外下觀察顏色變化。
[0017](4)結(jié)果判定:含有樣本核酸模板的反應(yīng)管在紫外下發(fā)出黑色熒光(FAM綠色熒光加紫色熒光的混合色)，此時(shí)樣本可判定為陽性。如含有樣本的反應(yīng)管為紫色，此時(shí)樣本可判定為陰性。如樣本反應(yīng)管發(fā)出淡紅色熒光則提示樣本提取過程中存在抑制反應(yīng)的成分，結(jié)果無效。
【具體實(shí)施方式】
[0018](I)DNA提取:DNA提取采用TAKARA細(xì)菌核酸提取專用試劑盒，提取方法參照說明書進(jìn)行。提取到的核酸樣本利用紫外分光光度計(jì)測量濃度，經(jīng)過換算得到每微升拷貝數(shù)。內(nèi)質(zhì)控同被檢測樣本同時(shí)參與DNA提取過程。
[0019](2)引物設(shè)計(jì):從Genebank下載核酸序列，選擇B族鏈球菌(GBS)保守基因(CAMP),設(shè)計(jì)合成SPIA引物，引物的5’端后八個(gè)堿基是RNA其余堿基是DNA。
[0020]Pl:5，-3，UCGAUCAUGTTAGCCGC
RIDA探針:根據(jù)前一步SPIA擴(kuò)增后的單鏈靶序列設(shè)計(jì)，探針序列:5’ -3’GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT 端標(biāo)記熒光基團(tuán)為FAM，端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA。探針序列下劃線部分為切刻內(nèi)切酶N.BstNBI對應(yīng)的識別位點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)控為插入了人GAPDH基因的質(zhì)粒DNA。內(nèi)質(zhì)控SPIA引物P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG 5’端后八個(gè)堿基是RNA其余堿基是DNA。
[0021 ]內(nèi)質(zhì)控 RIDA 探針:5’ -3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)為 TET, 端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA。
[0022]弓丨物和探針由TAKARA公司合成。
[0023](3)反應(yīng)體系:在 15 μ L SPIA 混和物(包含 I mmol/L dNTPs, 0.5 μ mol/L 反應(yīng)引物，0.5ymol/L 內(nèi)質(zhì)控引物，1μ I RNase H Buffer, 0.08U RNase H, 2U Bst DNA 聚合酶，I μ I Bst DNA聚合酶Buffer)中加入I μ L包含檢測標(biāo)本和內(nèi)質(zhì)控的DNA，混勻后在水浴鍋上60 °C加熱30 min,反應(yīng)結(jié)束后再加入I μ L 50 pmol/L反應(yīng)探針及內(nèi)質(zhì)控探針，2 μ L NEB buffer3, 5U N.BstNBI酶(NEB公司)。總反應(yīng)體積達(dá)到20 μ L。在水浴鍋上55°C繼續(xù)反應(yīng)15min后取出反應(yīng)管放置在紫外下觀察顏色變化。
[0024](4)結(jié)果判定:含有樣本核酸模板的反應(yīng)管在紫外下發(fā)出黑色熒光(FAM綠色熒光加紫色熒光的混合色)，此時(shí)樣本可判定為陽性。如含有樣本的反應(yīng)管為紫色，此時(shí)樣本可判定為陰性。如樣本反應(yīng)管發(fā)出淡紅色熒光則提示樣本提取過程中存在抑制反應(yīng)的成分，結(jié)果無效。
【權(quán)利要求】
1.一種B族鏈球菌(GBS)核酸檢測試劑盒，其特征在于， 該試劑盒含有: SPIA 反應(yīng)酶:Bst DNA 聚合酶；RNase H ； SPIA 反應(yīng)液:dNTPs，引物，Bst 酶 Buffer, RNase H Buffer ； RIDA反應(yīng)體系:切刻內(nèi)切酶選擇Nb.BtsI ； SPIA反應(yīng)引物:Pl.5’-3’UCGAUCAUGTTAGCCGC 5’端后八個(gè)堿基是RNA，其余堿基是DNA,
RIDA 探針:5’-3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT, 內(nèi)質(zhì)控SPIA引物:P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG 5’端后八個(gè)堿基是RNA，其余堿基是 DNA，
內(nèi)質(zhì)控 RIDA 探針:5’ -3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC, 內(nèi)質(zhì)控為插入了人GAPDH基因的質(zhì)粒DNA，內(nèi)質(zhì)控同被檢測樣本同時(shí)參與DNA提取過程; 空白對照為DEPC水； 陰性對照為甲型溶血性(草綠色)鏈球菌DNA，大腸桿菌DNA ； 陽性對照為B族鏈球菌(GBS) DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的B族鏈球菌(GBS)核酸檢測試劑盒，其特征在于，檢測探針 端標(biāo)記熒光基團(tuán)為FAM，3^端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA，內(nèi)質(zhì)控探針Y端標(biāo)記熒光基團(tuán)為TET，3,端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA。
3.一種利用權(quán)利要求1或2所述的試劑盒檢測B族鏈球菌(GBS)核酸的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)DNA提取:DNA提取采用TAKARA細(xì)菌核酸提取專用試劑盒，提取到的核酸樣本利用紫外分光光度計(jì)測量濃度，經(jīng)過換算得到每微升拷貝數(shù)，內(nèi)質(zhì)控同被檢測樣本同時(shí)參與DNA提取過程； (2)引物設(shè)計(jì):從Genebank下載核酸序列，選擇B族鏈球菌(GBS)保守基因(CAMP)，設(shè)計(jì)合成SPIA引物，引物的5’端后八個(gè)堿基是RNA，其余堿基是DNA，
Pl:5，-3，UCGAUCAUGTTAGCCGC， RIDA探針:根據(jù)前一步SPIA擴(kuò)增后的單鏈靶序列設(shè)計(jì)，探針序列:5’ -3’GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT 端標(biāo)記熒光基團(tuán)為FAM，端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA，探針序列下劃線部分為切刻內(nèi)切酶N.BstNBI對應(yīng)的識別位點(diǎn)，內(nèi)質(zhì)控為插入了人GAPDH基因的質(zhì)粒DNA，內(nèi)質(zhì)控SPIA引物P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG 5’端后八個(gè)堿基是RNA，其余堿基是DNA; 內(nèi)質(zhì)控 RIDA 探針:5’ -3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)為 TET, 3'端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)為TAMARA ； (3)反應(yīng)體系:在15μ L SPIA混和物(包含I mmol/L dNTPs, 0.5 μ mol/L反應(yīng)引物，0.5 μ mol/L 內(nèi)質(zhì)控引物，I μ I RNase H Buffer, 0.08 U RNase H, 2 U Bst DNA聚合酶，I μ I Bst DNA聚合酶Buffer)中加入I μ L包含檢測標(biāo)本和內(nèi)質(zhì)控的DNA,混勻后在水浴鍋上60 °C加熱30 min,反應(yīng)結(jié)束后再加入I μ L 50 pmol/L反應(yīng)探針及內(nèi)質(zhì)控探針，2 μ L NEB buffer3，5U N.BstNBI酶，總反應(yīng)體積達(dá)到20 μ L，在水浴鍋上55 V繼續(xù)反應(yīng)15 min后取出反應(yīng)管放置在紫外下觀察顏色變化； (4)結(jié)果判定:含有樣本核酸模板的反應(yīng)管在紫外下發(fā)出黑色熒光(FAM綠色熒光加紫色熒光的混合色)，此時(shí)樣本可判定為陽性，如含有樣本的反應(yīng)管為紫色，此時(shí)樣本可判定為陰性，如樣本反應(yīng)管發(fā)出淡紅色熒光，則提示樣本提取過程中存在抑制反應(yīng)的成分，結(jié)果無效。
【文檔編號】C12Q1/14GK103725761SQ201210384976
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月12日
【發(fā)明者】郭興中, 陳文 , 呂校祥 申請人:江蘇默樂生物科技有限公司