用于檢測冬生疫霉的引物對和探針及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測冬生疫霉的引物對和探針，所述引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法，其是以樣品總DNA為模板，利用上述引物對和探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。該方法可從發(fā)病植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境快速、準(zhǔn)確地檢測出冬生疫霉。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對冬生疫霉疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測以及進(jìn)出口安全等方面具有重要意義。
【專利說明】用于檢測冬生疫霉的引物對和探針及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測技術(shù)，具體地說，涉及一種用于檢測冬生疫霉的引物對和探針及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冬生疫霉(Phytophthora hibernalis Carne)是導(dǎo)致柑橘褐腐疫病的主要病原菌之一，柑橘褐腐疫病在果實(shí)采收前、采收后發(fā)生均可造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，尤其是在雨季。該病菌在澳大利亞西部的柑橘果實(shí)上首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在歐洲、美洲及非洲等許多國家均有報道。該病菌主要侵染柑橘屬植物的果實(shí)和枝葉，還可侵染杜鵑、玫瑰、紅花、芝麻、番茄、蘋果等多種植物，導(dǎo)致植物出現(xiàn)枯萎、根腐或潰瘍癥狀。
[0003]因此開發(fā)冬生疫霉的早期快速檢測技術(shù)，對相關(guān)植物生產(chǎn)中的病害防控和無公害化具有重要的意義。
[0004]近年來，實(shí)時熒光定量PCR (熒光RT-PCR)技術(shù)及其相關(guān)分子檢測技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長動態(tài)的分子檢測與預(yù)警，然而國內(nèi)外鮮有利用熒光RT-PCR技術(shù)檢測冬生疫霉方面的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測冬生疫霉的引物對和探針。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測冬生疫霉的引物對，其包括上游引物 PH-F:5，-CGACTTGCCACCGGGA-3，(SEQ IDN0.1)和下游引物 PH-R:5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0008]本發(fā)明還提供含有上述引物對PH-F和PH-R的用于檢測冬生疫霉的試劑盒。
[0009]本發(fā)明還提供一種用于檢測冬生疫霉的探針，所述探針為:5’-Fl-TTCCACAACCAATTCCAT-Ql-3’ (SEQ ID N0.3)，其中 Fl 為報告熒光基團(tuán)，Ql 為非熒光性的淬滅基團(tuán)。優(yōu)選Fl為FAM熒光染料，Ql為MGB。
[0010]本發(fā)明還提供一種檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法:以樣品DNA為模板，采用引物對PH-F和PH-R以及上述探針進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
[0011]上述熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，25yL的反應(yīng)體系含有成分如下:樣品DNAI μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反應(yīng)緩沖液(不含 Mg2+) 2.5 μ L, 25mM MgCL2 2.0 μ L, 2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探針 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
[0012]熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程中使用的退火溫度為60°C。優(yōu)選地，反應(yīng)程序為:950C 3min ；95°C 10s，60。。30s,40 個循環(huán)。
[0013]本發(fā)明還提供用于檢測冬生疫霉的試劑盒，其包括引物對PH-F和PH-R以及上述探針。
[0014]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
[0015]更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0016]本發(fā)明在測序分析冬生疫霉及其近似種和近緣種的ITS序列的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計用于檢測冬生疫霉的引物對和熒光探針。該探針與普通的Taqman探針不同之處在于3’端采用了非熒光性的淬滅基因，即淬滅基團(tuán)吸收報告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。
[0017]Taqman MGB探針技術(shù)，即將報告熒光染料標(biāo)記在探針的5’端，而3’端采用了非熒光性的淬滅基因，二者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅基團(tuán)吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強(qiáng)。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，探針同模板上的目的擴(kuò)增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴(kuò)增延伸階段將探針切斷，淬滅基團(tuán)的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對冬生疫霉的檢測。
[0018]本發(fā)明根據(jù)冬生疫霉ITS序列，設(shè)計出可快速檢測冬生疫霉病菌的特異性引物對和探針，并在此基礎(chǔ)上建立了熒光RT-PCR檢測法，可從發(fā)病植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境快速、準(zhǔn)確地檢測出冬生疫霉。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對冬生疫霉疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測以及進(jìn)出口安全等方面具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明實(shí)施例4中采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測冬生疫霉的結(jié)果示意圖，其中，1:冬生疫霉(Phytophthora hibernalis,來源于澳大利亞)；2:冬生疫霉(P.hibernalis,來源于英國);3_4:丁香疫霉(P.syringae) ;5_7:雪松疫霉(P.lateralis)；8-9:櫟樹粹死病菌(P.ramorum) ；10-11:苜猜疫霉根腐病菌(P.medicaginis) ；12-13:馬鈴薯緋腐疫霉(P.erythroseptica) ;14_16:栗黑水疫霉(P.cambivora) ;17_18:草莓疫霉(P.fragariae) ; 19-20:樹霉疫霉(P.fragariae var.rubi) ；21:大豆疫霉(P.sojae) ；22:棕櫚疫霉(P.palmivora) ；23:辣椒霜霉(P.capsici) ；24:康沃爾疫霉(P.kernoviae) ；25:空白對照。
[0020]圖2是本發(fā)明實(shí)施例5中熒光RT-PCR檢測方法的靈敏度實(shí)驗結(jié)果示意圖，其中，1_8 的 DNA 濃度分別為 50ng/ μ L、5ng/ μ L、0.5ng/ μ L、0.05ng/ μ L、0.005ng/ μ L、
0.0005ng/y L、0.00005ng/y L 和 0.000005ng/μ L, 9 為空白對照。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022]以下實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗條件，如SambiOOk等分子克隆實(shí)驗手冊(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper 等(Blackwell 科學(xué)出版社，1988)，鄭小波(疫霉菌及其研究技術(shù)，中國農(nóng)業(yè)出版社，1997)中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照制造廠商所建議的實(shí)驗條件。[0023]實(shí)施例1引物對及探針的設(shè)計與合成
[0024]根據(jù)冬生疫霉ITS序列，采用探針設(shè)計軟件Express 3.0設(shè)計引物對及探針，引物對序列為:
[0025]PH-F (正向引物):5’ -CGACTTGCCACCGGGA-3’
[0026]PH-R (反向引物):5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’
[0027]探針的序列為:5’-F1-TTCCACAACCAATTCCAT-Q1-3';其中，F(xiàn)l 為 FAM 熒光染料，Ql為非熒光性的淬滅基團(tuán)MGB。
[0028]上述引物對及探針序列合成由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。
[0029]實(shí)施例2樣品總DNA的提取
[0030]包括以下步驟:
[0031]I)采集適量冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)真菌菌絲體或染病果實(shí)、葉片，用液氮研成粉末，取0.4g裝入1.5mL離心管中。
[0032]2)預(yù)熱CTAB提取液至65°C，向裝有粉末的1.5mL離心管中加入600 μ L預(yù)熱的CTAB提取液，混勻。
[0033]3)立即置于65°C水浴30min，然后加入5001^氯仿/異戊醇(24:1，體積比)，上下顛倒數(shù)次，13000g離心I分鐘。
[0034]4)吸取上清液約400 μ L至一個新的2.0ml離心管中，加入500 μ I氯仿/異戊醇(24:1) ,500 μ L CTAB提取液，輕輕混勻，13000g離心I分鐘。
[0035]5)取800μ I上清液至一個新的1.5mL離心管中，加入500μ L異丙醇，輕輕混勻，室溫放置20min。
[0036]6) 13000g離心2min，去上清，用70%乙醇洗沉淀，室溫干燥。
[0037]7)力卩入 50 μ L IXTE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，含 20 μ gRNase，pH 值
8.0 )，置于4°C過夜，待DNA溶解后，檢測DNA濃度及質(zhì)量。
[0038]實(shí)施例3實(shí)時熒光定量PCR (突光RT-PCR)法的建立
[0039]1、熒光RT-PCR反應(yīng)體系
[0040]以總DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(總體積25 μ L)為:樣品DNAI μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反應(yīng)緩沖液(不含 Mg2+) 2.5 μ L, 25mM MgCL2 2.0 μ L, 2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探針 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
[0041]2、實(shí)時熒光PCR反應(yīng)條件
[0042]將樣品管放入BIO-RAD公司IQ?5熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng):第I個循環(huán)為95°C 3min;然后是95°C 10s,60°C 30s，40個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
[0043]實(shí)施例4冬生疫霉熒光RT-PCR檢測法的特異性分析
[0044]以冬生疫霉的總DNA為模板，以冬生疫霉的近似種及近緣種的總DNA為對照，通過熒光RT-PCR檢測熒光強(qiáng)度變化。
[0045]試驗結(jié)果:
[0046]以冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的總DNA為模板，通過實(shí)時突光PCR檢測可觀察到明顯的熒光強(qiáng)度變化，而冬生疫霉的近似種及近緣種，如丁香疫霉(P.syringae)、雪松疫霉(P.lateralis)、櫟樹粹死病菌(P.ramorum)、苜猜疫霉根腐病菌(P.medicaginis)、馬鈴薯緋腐疫霉(P.erythroseptica)、栗黑水疫霉(P.cambivora)、草莓疫霉(P.fragariae)、樹霉疫霉(P.fragariae var.rubi )、大豆疫霉(P.spjae)、棕櫚疫霉(P.palmivora)、辣椒霜霉(P.capsici )、康沃爾疫霉(P.kernoviae)的突光強(qiáng)度沒有變化，檢測結(jié)果如圖1所示。
[0047]實(shí)施例5冬生疫霉熒光RT-PCR檢測法的靈敏度分析
[0048]用超純水分別稀釋冬生疫霉的DNA，進(jìn)彳了相對靈敏度檢測，在25 μ L反應(yīng)體系中，DNA 分別為 50ng/μ L、5.0ng/μ L、0.5ng/μ L、0.05ng/μ L、0.005ng/μ L、0.0005ng/μ L、0.00005ng/ μ L和0.000005ng/ μ L。檢測結(jié)果如圖2所示，最低檢測限為0.0005ng/ μ L。
[0049]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的 基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測冬生疫霉的引物對，其特征在于，
上游引物 PH-F:5’ -CGACTTGCCACCGGGA-3’，
下游引物 PH-R:5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’。
2.用于檢測冬生疫霉的探針，其特征在于，所述探針為:5’ -F1-TTCCACAACCAATTCCAT-Q1-3'，其中Fl為報告熒光基團(tuán)，Ql為非熒光性的淬滅基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，F(xiàn)l為FAM，Ql為MGB0
4.檢測冬生疫霉的熒光RT-PCR法，其特征在于，以樣品DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物對以及權(quán)利要求2或3所述的探針進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，25μ L的反應(yīng)體系含有成分如下:樣品DNA I μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反應(yīng)緩沖液(不含 Mg2+)2.5 μ L, 25mM MgCL22.0 μ L，2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探針 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)程序為:95°C3min ；95 °C 10s,60°C 30s, 40 個循環(huán)。
7.用于檢測冬生疫霉的試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的引物對以及權(quán)利要求2或3所述的探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征`在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
10.含有權(quán)利要求1所述引物對的用于檢測冬生疫霉的試劑盒。
【文檔編號】C12N15/11GK103725762SQ201210385102
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月11日
【發(fā)明者】杜洪忠, 吳品珊 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院