從生物樣本提取核酸的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提出了從生物樣本提取核酸的方法。從生物樣本提取核酸的方法包括：裂解所述生物樣本，以便得到含有核酸的裂解產(chǎn)物；以及從所述裂解產(chǎn)物中分離所述核酸，其中，裂解所述生物樣本進(jìn)一步包括：利用含有溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的混合物，對(duì)所述生物樣本進(jìn)行消化；將消化產(chǎn)物離心，收集沉淀；以及利用裂解液，對(duì)所述沉淀進(jìn)行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解產(chǎn)物。利用該方法可以有效地從生物樣本中提取核酸。
【專(zhuān)利說(shuō)明】從生物樣本提取核酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境微生物學(xué)，具體地，本發(fā)明涉及收集流體中微生物和提取核酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]空氣是人類(lèi)賴(lài)以生存的環(huán)境，也是微生物擴(kuò)散與傳播疾病的介質(zhì)，空氣中微生物主要包括細(xì)菌、真菌、病毒和放線菌等多種微生物，這是空氣污染的主要組成部分，這些微生物的產(chǎn)生與人類(lèi)活動(dòng)有密切的關(guān)系?？諝庵形⑸镏饕獊?lái)源于自然界的水體、土壤、動(dòng)植物和人類(lèi)，農(nóng)業(yè)活動(dòng)、動(dòng)物飼養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)、污水處理、發(fā)酵過(guò)程和食品生產(chǎn)廠等，空氣中微生物的多少是空氣質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。要了解空氣中的微生物就必須將微生物富集，以便觀察和分析，這就需要特殊設(shè)計(jì)的空氣微生物采樣器。
[0003]空氣微生物采樣方法主要分為自然沉降法和機(jī)器采樣法。自然沉降法是利用空氣微生物粒子的重力作用，在一定的時(shí)間內(nèi)，讓所處區(qū)域的空氣中微生物顆粒逐步沉降到帶有培養(yǎng)介質(zhì)的平皿內(nèi)的一種采樣方法。由于此方法是被動(dòng)取樣，采樣條件難以控制，微生物粒子的漂移、擴(kuò)散和沉降會(huì)受到風(fēng)力、電力、磁力、熱力、浮力和擴(kuò)散力等各種力的干擾，因此這種采樣方法會(huì)造成很大的誤差。機(jī)器采樣法是用采樣器來(lái)采樣，根據(jù)采樣原理，采樣器可分為沉降式、撞擊式、離心撞擊式、過(guò)濾式、靜電式、氣旋式等。此外，還有溫差迫降類(lèi)和生物類(lèi)。各種采樣器的研制和使用大大推動(dòng)了空氣微生物學(xué)的發(fā)展，但仍無(wú)一種采樣器是十全十美的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問(wèn)題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種從生物樣本中提取核酸的方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種從生物樣本中提取核酸的方法。該提取方法包括:裂解所述生物樣本，以便得到含有核酸的裂解產(chǎn)物；以及從所述裂解產(chǎn)物中分離所述核酸，其中，裂解所述生物樣本進(jìn)一步包括:利用含有溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的混合物，對(duì)所述生物樣本進(jìn)行消化；將消化產(chǎn)物離心，收集沉淀；以及利用裂解液，對(duì)所述沉淀進(jìn)行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從生物樣本提取核酸的方法，可以有效地從生物樣本中提取核酸，對(duì)微生物破壁的效果明顯，可以同時(shí)提取DNA和RNA，特別是RNA的完整性和純度都非常高， 同時(shí)這種方法也適用于各種環(huán)境樣品例如空氣中微生物的核酸的提取。
[0006]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從生物樣本提取核酸的方法可用于收集各種不同開(kāi)放環(huán)境的空氣樣本，不僅覆蓋面廣而且操作簡(jiǎn)便。另外，本發(fā)明中提供的提取空氣樣本核酸的方法非常有效。
[0007]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0009]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的收集流體中微生物的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖，其中A、B和C分別顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的收集流體中微生物的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖；
[0010]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的收集流體中微生物的設(shè)備的過(guò)濾收集組件的立體分解示意圖；
[0011]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從空氣樣本中提取RNA后用2100芯片檢測(cè)的結(jié)果圖；
[0012]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的空氣樣本核酸(DNA和RNA)用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的電泳圖；
[0013]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的只采用溶菌酶提取空氣樣本IRNA提取后用2100芯片檢測(cè)的結(jié)果圖；
[0014]圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的只采用溶菌酶空氣樣本I核酸(DNA和RNA)用
0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的電泳圖；
[0015]圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)從胃瘤樣本中提取的核酸片段大小，Nanodrop儀器檢測(cè)DNA濃度及純度；以及
[0016]圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明又一實(shí)施例的采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)從牙菌斑樣本中提取的核酸片段大小，Nanodrop儀器檢測(cè)DNA濃度及純度。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0018]本發(fā)明提供了一種從生物樣本中提取核酸的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該提取核酸的方法包括以下步驟:裂解所述生物樣本，以便得到含有核酸的裂解產(chǎn)物；以及從所述裂解產(chǎn)物中分離所述核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，裂解所述生物樣本進(jìn)一步包括:利用含有溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的混合物，對(duì)所述生物樣本進(jìn)行消化；將消化產(chǎn)物離心，收集沉淀；以及利用裂解液，對(duì)所述沉淀進(jìn)行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例，優(yōu)選地，所述溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的比例為1:1:lo發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的組合，能夠有效地對(duì)生物樣本進(jìn)行消化，從而能夠以顯著高于現(xiàn)有技術(shù)的效率，從生物樣本尤其是從空氣中所收集的微生物中提取核酸。為此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從生物樣本提取核酸的方法，可以有效地從生物樣本中提取核酸，尤其是對(duì)微生物破壁的效果明顯，可以同時(shí)提取DNA和RNA，特別是RNA的完整性和純度都非常高，同時(shí)這種方法也適用于各種環(huán)境樣品例如空氣中微生物的核酸的提取。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以用于本發(fā)明的裂解液的類(lèi)型并不受特別限制根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例， 所述裂解液可以含有200mmol/L NaCl, 100mmol/LTris-HCl, pH
8.0, 2.0%SDS, 50mmol/L EDTA, 0.5%Triton X-100。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例，所述裂解液中可以進(jìn)一步含有蛋白酶K。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述裂解是在50-55攝氏度下進(jìn)行的。由此，可以進(jìn)一步提高裂解生物樣品尤其是從微生物樣品的效率，從而進(jìn)一步提高從生物樣品提取核酸的效率。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從該裂解產(chǎn)物中分離核酸進(jìn)一步包括:對(duì)所述裂解產(chǎn)物進(jìn)行離心，收集第一上清液；將含有酚、氯仿和異戊醇的混合物與所述第一上清液按照等體積混合，進(jìn)行離心后，收集第二上清液，其中，所述含有酚、氯仿和異戊醇的混合物中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1 ;將含有氯仿和異戊醇的混合物與所述第二上清液按照等體積混合，進(jìn)行離心后，收集第三上清液；以及將含有異丙醇和醋酸鈉的混合物與所述第三上清液按照0.7:1的體積比混合，進(jìn)行離心后，收集核酸沉淀。由此，可以進(jìn)一步顯著地提高所得到核酸樣品的純度。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用本發(fā)明的方法提取核酸的樣品來(lái)源并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所采用的生物樣本是從流體收集的微生物樣本。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過(guò)下列方法從流體收集微生物樣本:
[0022]在壓力差的作用下，使含有微生物的流體通過(guò)濾膜，其中，所述濾膜進(jìn)樣側(cè)的壓力高于所述濾膜出樣側(cè)的壓力，所述濾膜的孔徑使得所述微生物被截留在所述濾膜上。由此，可以有效地從流體中收集微生物樣本，從而進(jìn)一步提高從生物樣品提取核酸的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用本發(fā)明的方法進(jìn)行處理的微生物樣本類(lèi)型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)例，所述微生物可以為選自細(xì)菌、真菌、病毒和放線菌的至少之一。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的流體類(lèi)型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，可以采用的流體為氣體，例如可以為空氣。由此，利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以有效地從氣體例如空氣中收集微生物樣品。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，壓力差是通過(guò)所述出樣側(cè)形成空氣的定向流動(dòng)形成的，其最佳壓力范圍是高于lOOOPa，并且不超過(guò)3000Pa。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)壓力差不超過(guò)1000Pa時(shí)，流體尤其是空氣將難以有效地通過(guò)濾膜，從流體尤其是空氣中收集生物樣本尤其是微生物的效率將顯著降低，而當(dāng)壓力超過(guò)3000Pa時(shí)，生物樣本尤其是微生物樣本將難以停留在濾膜上，從而收集生物樣本尤其是微生物的效率也將顯著降低。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例，所述濾膜的孔徑大小并不受特別限制，可以為0.1~10微米。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例，所述濾膜的種類(lèi)也不受特別限制，可以為選自尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纖維膜的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選醋酸纖維膜，因?yàn)榇姿崂w維膜具有很高的流速和熱穩(wěn)定性以及非常低的吸附，非常適合除菌過(guò)濾。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述醋酸纖維膜的孔徑可以為0.22微米。
[0026]為了方便理解，下面對(duì)可以用于實(shí)施從流體尤其是空氣收集生物樣本尤其是微生物的設(shè)備進(jìn)行描述。
[0027]在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明還提出了一種用于從流體尤其是空氣中收集微生物的設(shè)備。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參考圖1A~C，該設(shè)備1000發(fā)明的實(shí)施例，收集流體中微生物的設(shè)備1000包括:本體100、過(guò)濾收集組件200以及負(fù)壓發(fā)生組件300。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本體100內(nèi)限定有負(fù)壓腔110，負(fù)壓發(fā)生裝置300設(shè)置在負(fù)壓腔110內(nèi)，用于在負(fù)壓腔110內(nèi)形成負(fù)壓，過(guò)濾收集組件200設(shè)置在負(fù)壓腔110的至少一偵牝以便使得流體可以 通過(guò)過(guò)濾收集組件200進(jìn)入負(fù)壓腔110。[0029]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于收集流體中微生物的設(shè)備采用了非自然沉降的富集方式，可以克服被動(dòng)取樣，防止微生物的漂移、擴(kuò)散和受到風(fēng)力、電力、磁力、熱力、浮力和擴(kuò)散力等各種里的干擾。尤其是，通過(guò)采用主動(dòng)式的直接吸入過(guò)濾收集方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)全部微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒等在內(nèi)的一次性同步收集，這克服了現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基采樣方法的缺陷，從而有效地收集流體中微生物樣本。在現(xiàn)有的培養(yǎng)基采樣方法，由于營(yíng)養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式差異，會(huì)造成空氣微生物收集的局限性。
[0030]需要說(shuō)明的是，雖然在附圖中所給出的設(shè)備是立式的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，也可以采用其他形式，例如臥式。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，負(fù)壓發(fā)生組件300的類(lèi)型并不受特別限制，例如可以為抽真空裝置。另外，參考圖1B和C，負(fù)壓發(fā)生組件300進(jìn)一步包括葉片320 ;驅(qū)動(dòng)裝置310，所述驅(qū)動(dòng)裝置320與所述葉片310通過(guò)連接桿330相連，用于驅(qū)動(dòng)所述葉片轉(zhuǎn)動(dòng)。從而通過(guò)葉片310的轉(zhuǎn)動(dòng)，驅(qū)動(dòng)負(fù)壓腔110內(nèi)空氣的流動(dòng)，可以在負(fù)壓腔內(nèi)形成局部負(fù)壓，從而驅(qū)動(dòng)流體通過(guò)過(guò)濾收集組件200進(jìn)入負(fù)壓腔110。根據(jù)本發(fā)明的示例，在與所述過(guò)濾收集組件相對(duì)的側(cè)壁上形成有通孔120。由此，可以在葉片310的轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中，將負(fù)壓腔110中的氣體排出負(fù)壓腔110，從而可以在負(fù)壓腔110中形成持續(xù)穩(wěn)定的負(fù)壓，從而有效地提高了收集生物樣本尤其是微生物樣本的效率。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)例，所述葉片310與過(guò)濾收集組件200相對(duì)設(shè)置，并且過(guò)濾收集組件可拆卸地與所述殼體相連。由此，可以進(jìn)一步有效地通過(guò)葉片旋轉(zhuǎn)帶動(dòng)空氣流動(dòng)，并從通孔120將空氣排出，從而在負(fù)壓腔110種形成負(fù)壓，簡(jiǎn)單方便地形成負(fù)壓。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，收集流體中微生物的設(shè)備1000進(jìn)一步包括:限位部件400，所述限位部件400設(shè)置在所述本體110上，用于對(duì)所述過(guò)濾收集組件200進(jìn)行限位。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)例，限位部件400可移動(dòng)地設(shè)置在所述本體110上。由此，可以對(duì)過(guò)濾收集組件200的位置進(jìn)行限定。
[0034]參考圖2根據(jù)本發(fā)明的示例，過(guò)濾收集組件200包括:濾膜22 ;膜前收集網(wǎng)格槽21 ;和膜后網(wǎng)式襯墊23，其中，所述濾膜22設(shè)置在所述膜前收集網(wǎng)格槽21和所述膜后網(wǎng)式襯墊23之間。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，濾膜22的孔徑大小并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以為0.1~10微米。所述濾膜的種類(lèi)也不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以為選自尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纖維膜的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例，所述濾膜優(yōu)選為醋酸纖維膜。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，過(guò)濾收集組件200進(jìn)一步包括:密封框架24，所述密封框架24設(shè)置于膜前收集網(wǎng)格槽21和膜后網(wǎng)式襯墊23之間，用于對(duì)收集網(wǎng)格槽24與膜后網(wǎng)式襯墊22進(jìn)行密封。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該密封框架24的材質(zhì)并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的示例，所述框架可以為橡膠框架。由此，可保證膜前收集網(wǎng)格槽24與膜后網(wǎng)式襯墊22的密封連接。
[0036]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者 ，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購(gòu)自Illumina公司。
[0037]實(shí)施例1
[0038]1、樣本收集前準(zhǔn)備
[0039]根據(jù)圖1C和圖2所示結(jié)構(gòu)，取一塊新的醋酸纖維素膜，將過(guò)濾收集組件與殼體連接，準(zhǔn)備好收集裝備。
[0040]2、樣本收集
[0041]將空氣富集裝置開(kāi)關(guān)打開(kāi)，在1000Pa〈H≤3000Pa壓力下，分別在兩個(gè)釀酒廠的車(chē)間內(nèi)連續(xù)開(kāi)機(jī)抽氣3天，抽氣結(jié)束后，取出網(wǎng)格槽內(nèi)濾膜，在超凈臺(tái)內(nèi)，撕下濾膜收集菌體,收集得空氣樣本I和空氣樣本2。
[0042]3、空氣樣本核酸提取
[0043]將收集到的菌體與撕下來(lái)的表層濾膜一起置于50mL離心管中，向其中加入20mLΤΕ,200μ L 1011^/11^溶菌酶、20(^1^ 10mg/mL 蝸牛酶和 200 μ L 10mg/mL 溶壁酶，吹吸混勻，37°C溫育過(guò)夜，消化同時(shí)用混勻儀混勻(過(guò)夜消化)；將所得消化液在4°C 9000r/min下離心IOmin,棄去上清液；向沉淀中加入6mL TENS裂解液(200mmol/L NaCl, IOOmmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 2.0%SDS, 50mmol/L EDTA, 0.5%Triton X-100)和 20mg/mL 蛋白酶 K300 μ L，顛倒混勻，55°C溫浴lh，每隔15min顛倒混勻一次；將裂解后樣品在4°C 1000Or/min條件下離心IOmin,留取上清液,棄去沉淀；向所得上清液中加入等體積的酹:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分混勻，然后在4°C 12000r/min下離心IOmin ;轉(zhuǎn)移所得上清液至新管，向其中加入等體積的氯仿:異戍醇(24:1),充分混勻,在4°C 12000r/min下離心IOmin ;將所得上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，向其中加入0.7倍體積異丙醇和100 μ L 5Μ醋酸鈉，沉淀2h后,在4? 13000rpm條件下離心30min ;棄去所得上清液,用冰預(yù)冷的75%乙醇漂洗沉淀二次，在4°C 13000rpm條件下離心5min ;棄去上清液,風(fēng)干,沉淀用30 μ L無(wú)菌水溶解,若只提取RNA，可加入I μ L無(wú)RNA酶的DNA酶I來(lái)溶解沉淀；然后采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小，Nanodrop儀器和2100芯片分別檢測(cè)所提取核酸的DNA和RNA濃度及純度。
[0044]4、空氣樣本提取結(jié)果
[0045]圖3顯示了從空氣樣本中提取RNA后用2100芯片檢測(cè)的結(jié)果圖；圖4顯示了空氣樣本核酸(DNA和RNA)用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的電泳圖。
圖3示出了:
【權(quán)利要求】
1.一種從生物樣本提取核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟: 裂解所述生物樣本，以便得到含有核酸的裂解產(chǎn)物；以及 從所述裂解產(chǎn)物中分離所述核酸， 其中，裂解所述生物樣本進(jìn)一步包括: 利用含有溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的混合物，對(duì)所述生物樣本進(jìn)行消化； 將消化產(chǎn)物離心，收集沉淀；以及 利用裂解液，對(duì)所述沉淀進(jìn)行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的質(zhì)量比為1:1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液含有200mmol/LNaCl,100mmoL/L Tris-HCl,pH 8.0,2.0%SDS,50mmol/L EDTA，0.5%Triton X-100， 任選地，所述裂解液中進(jìn)一步含有蛋白酶K， 任選地，所述裂解是在50~55攝氏度下進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述裂解產(chǎn)物中分離核酸進(jìn)一步包括: 對(duì)所述裂解產(chǎn)物進(jìn) 行離心，收集第一上清液； 將含有酚、氯仿和異戊醇的混合物與所述第一上清液按照等體積混合，進(jìn)行離心后，收集第二上清液，其中，所述含有酚、氯仿和異戊醇的混合物中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1 ； 將含有氯仿和異戊醇的混合物與所述第二上清液按照等體積混合，進(jìn)行離心后，收集第二上清液；以及 將含有異丙醇和醋酸鈉的混合物與所述第三上清液按照0.7:1的體積比混合，進(jìn)行離心后，收集核酸沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物樣本是通過(guò)下列步驟從流體中收集的微生物樣本: 在壓力差的作用下，使含有微生物的流體通過(guò)濾膜， 其中， 所述濾膜進(jìn)樣側(cè)的壓力高于所述濾膜出樣側(cè)的壓力， 所述濾膜的孔徑使得所述微生物被截留在所述濾膜上， 任選地，所述流體為氣體， 任選地，所述氣體為空氣， 任選地，所述壓力差是通過(guò)所述出樣側(cè)空氣的定向流動(dòng)形成的，優(yōu)選，所述壓力差為1000Pa〈H ≤ 3000Pa, 任選地，所述微生物為選自細(xì)菌、真菌、病毒和放線菌的至少之一。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述濾膜的孔徑為0.1~10微米。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述濾膜為選自尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纖維膜的至少之一。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述濾膜為醋酸纖維膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述醋酸纖維膜的孔徑為0.22微米。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103725670SQ201210389988
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月15日
【發(fā)明者】郭晶, 章文蔚, 肖亮, 李子華 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司, 深圳華大基因研究院