專利名稱：玉米低植酸基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及一種玉米低植酸基因的分子標(biāo)記，以及該分子標(biāo)記在玉米低植酸基因輔助選擇上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植酸又稱肌醇-6-磷酸，是玉米、小麥、大麥、水稻和大豆等籽粒中廣泛存在的一種有機(jī)酸(Stephens L 等 Journal of Biological Chemistry. 1993. 268 :4009-4015),植酸含有 12 個(gè)可解離的氫原子(Johnson LF 等 CanadianJournal of Chemistry, 1969. 47 63-73)，這些位點(diǎn)可與K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ba2+和Fe3+等陽離子結(jié)合形成植酸鹽(LottJNA 等.Seed Development andGermination. Marcel Dekker,New York,1995,pp. 215-235。Otegui MS等.The Plant Cell,2002. 14 :1311-1327)。植酸及植酸鹽不能被人和單胃動(dòng)物吸收利用；植酸攝入體內(nèi)后還會(huì)和其他來源的微量營養(yǎng)元素結(jié)合形成植酸鹽，造成這些營養(yǎng)元素的生物有效性下降，從而造成微量元素缺乏癥。此外，大量的植酸及植酸鹽隨糞便排出，造成嚴(yán)重環(huán)境污染，尤其是水體富營養(yǎng)化。由于土壤中缺乏分解微生物，即使畜禽糞便作有機(jī)肥還田仍不能被作物吸收利用。應(yīng)用低植酸作物可大大降低動(dòng)物糞便等排泄物中磷的含量，從而顯著減輕由于磷過量排放所引起的環(huán)境污染和水體富營養(yǎng)化等問題。在魚的日糧中用低植酸玉米代替普通玉米，可減少糞磷41 %。當(dāng)磷的含量降到魚的最低需要量時(shí)，用低植酸玉米代替普通玉米效果更明顯。因此，降低作物籽粒中的植酸含量有利于提高作物和人畜對(duì)磷的利用效率，從而減輕此類污染。植酸是作物籽粒中主要含磷化合物，通常占籽粒干重的1%以上，占全磷含量的65-85 %。在玉米籽粒中，約90 %的植酸貯存于盾片層中，糊粉層所含植酸約占總量的10%。植酸對(duì)作物的生長發(fā)育具有重要的作用，但在玉米種子用作飼料時(shí)，由于單胃動(dòng)物缺少水解植酸的酶類，不能對(duì)植酸磷進(jìn)行很好的吸收和利用，所以植酸磷實(shí)際上是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。此外，植酸鹽排出動(dòng)物體后，也會(huì)對(duì)水體環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。為降低動(dòng)物排泄物中的植酸含量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，動(dòng)物飼料中往往要添加植酸酶，用來降解植酸，但由此會(huì)帶來成本提高。中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所通過轉(zhuǎn)基因在玉米種子中表達(dá)植酸酶，有望在飼料加工過程中對(duì)植酸進(jìn)行降解，以實(shí)現(xiàn)降低飼料植酸的目的，該轉(zhuǎn)基因玉米材料已經(jīng)獲得環(huán)境釋放安全證書(農(nóng)基安證字(2009)第074號(hào))。通過育種手段降低作物中植酸的含量，是解決與植酸相關(guān)的營養(yǎng)和環(huán)保問題的新途徑。迄今為止，通過理化誘變等方法，在玉米、小麥、水稻、大豆等作物中獲得了植酸含量較低的突變體，在這些突變體中，植酸含量均表現(xiàn)為下降，相應(yīng)地?zé)o機(jī)磷以及肌醇磷酸鹽含量上升。低植酸突變大多表現(xiàn)為隱性突變，并受單基因控制，其控制基因主要是參與或調(diào)控植酸的合成代謝。低植酸突變體有三種類型，分別命名為Ipal、lpa2和lpa3，其中Ipal和lpa2突變體的植酸含量下降66%和30%，lpa3的植酸含量介于二者之間(Raboy，Gerbasi等 PlantPhysiol 2000，124(1) :355-368. Shi，Wang 等 Plant J,200542(5) :708-719)。三種類型的低植酸突 變?cè)谟衩字芯袌?bào)道，它們分別受不同的基因控制，Ipal是由于玉米多藥抗性蛋白4基因(Multidrug resistance-associatedprotein 4,簡寫為ZmMRP4)的突變?cè)斐傻?，該突變使體內(nèi)合成的植酸向胞外運(yùn)輸受阻，形成負(fù)反饋抑制，造成植酸的合成量降低；另外，植酸合成的關(guān)鍵酶肌醇磷酸合成酶(Myo-1nositol phosphatesynthase,簡寫為MIPS)的表達(dá)量下降也會(huì)產(chǎn)生Ipal表型；lpa2是植酸合成途徑下游的肌醇磷酸激酶(簡寫為ZmIpk)基因突變?cè)斐傻?，其中l(wèi)pa2-l是由于ZmIpk的插入失活造成的，lpa2-2是由于玉米肌醇磷酸激酶(ZmIpk)中的一個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致開放閱讀框的提前終止，產(chǎn)生無功能的蛋白質(zhì)造成的；lpa3是由于肌醇激酶(MIK)基因發(fā)生突變引起肌醇積累造成的(Shi，Wang 等.Plant J. 2005,42(5) :708-719)。Ipal 和 lpa2 位點(diǎn)都定位于 I 號(hào)染色體短臂(Shi, Wang 等.Nat Biotechnol. 2007,25(8) :930-937. Pilu,Panzeri等 Heredity. 2009,102 (3) :236-245. Cerino Badone,Amelotti等 J Hered.2012103(4) :598-605. )，lpa3 定位于 I 號(hào)染色體的長臂上(Shi，Wang 等 Plant J. 2005,42(5)708-719)。利用誘變處理，我國從玉米自交系黃C和X178中獲得了 6個(gè)低植酸突變體，與野生型相比，植酸磷下降了 43-79% (王雪艷等.核農(nóng)學(xué)報(bào).2006，20 (I) :404-408)。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)從20份常用玉米自交系中，篩選到低植酸自交系齊319，將該自交系與Lpa241/lpa241雜交，通過8粒F1種子的分離結(jié)果，初步認(rèn)為該低植酸性狀受隱性單基因控制(王暉等.作物學(xué)報(bào) 2008，34 (I) :95-99)。專利《一種低植酸玉米品種的育種方法》(專利號(hào)為ZL200710002627. 0)公開了利用低植酸玉米自交系齊319選育低植酸玉米品種的方法，但是由于該低植酸性狀受單隱性基因控制，因此每次雜交后需要自交一代，以便通過隱性性狀純合，再通過測(cè)定其無機(jī)磷含量對(duì)低植酸性狀進(jìn)行選擇，該方法存在育種周期長，方法繁瑣，成本高等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于 提供一種玉米低植酸基因的分子標(biāo)記，利用該分子標(biāo)記可對(duì)玉米低植酸基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，從而對(duì)育種后代的隱性低植酸基因進(jìn)行直接選擇，而且不必進(jìn)行自交，也不必對(duì)育種后代進(jìn)行無機(jī)磷含量檢測(cè)，育種周期短，育種效率高。本發(fā)明另一目的在于提供上述玉米低植酸基因的分子標(biāo)記在低植酸玉米育種上的應(yīng)用。本發(fā)明第三目的在于提供利用上述玉米低植酸基因的分子標(biāo)記培育低植酸玉米品種的方法。本發(fā)明第四目的在于提供用于擴(kuò)增上述玉米低植酸基因分子標(biāo)記的引物對(duì)。本發(fā)明第五目的在于提供含有玉米低植酸基因分子標(biāo)記的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明玉米低植酸基因的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記為兩個(gè)，擴(kuò)增該2個(gè)分子標(biāo)記的引物對(duì)分別為IDP7818和IDP7635，其中引物對(duì)IDP7818由SEQ IDNo :1和SEQ ID No 2所示的核苷酸序列組成，即上游引物:5，GATTACCTGAACGGGAAGGG3’ (SEQ ID No 1),下游引物5’CGTGGTTGTTAAGGTAGGGC 3’ (SEQ ID No 2)；引物對(duì)IDP7635由SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示的核苷酸序列組成，即上游引物5，ACCACCACCTCAACTTCTCG3，(SEQ ID No 3),
下游引物:5，AGCACCCTCTTGTAGAACGG3’ (SEQ ID No :4)。上述分子標(biāo)記中所述的玉米低植酸基因位于玉米第2號(hào)染色體的長臂上，命名為lpa319 ;利用引物對(duì)IDP7818擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記與Lpa319的遺傳距離為0. 6cM，利用引物對(duì)IDP7635擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記與lpa319的遺傳距離為1. 9cM，兩個(gè)分子標(biāo)記分別位于lpa319的兩側(cè)。因以前所報(bào)道的玉米低植酸基因Ipal、lpa2、lpa3都位于玉米第I號(hào)染色體上，而本發(fā)明的玉米低植酸基因lpa319位于玉米第2號(hào)染色體上，因此推斷l(xiāng)pa319為新的玉米低植酸基因。上述分子標(biāo)記，利用引物對(duì)IDP7818進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的特異片段大小約為410bp。上述分子標(biāo)記，利用引物對(duì)IDP7635進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的特異片段大小約為230bp。上述分子標(biāo)記，可以是以齊319的總DNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增而得。上述玉米低植酸基因的分子標(biāo)記在低植酸玉米育種上的應(yīng)用；所述的低植酸基因是lpa319，lpa319位于玉米第2號(hào)染色體的長臂上。利用上述低植酸基因的分子標(biāo)記培育低植酸玉米品種的方法，包括以具有低植酸基因lpa319的玉米品種為親本之一，通過回交、雜交或組織培養(yǎng)的方法培育低植酸玉米自交系，主要是在后代中選擇同時(shí)具有低植酸基因lpa319的兩個(gè)分子標(biāo)記、并且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的后代，連續(xù)進(jìn)行4-5代，即可獲得低植酸玉米自交系；其中所述的兩個(gè)分子標(biāo)記是在苗期提取的葉片總DNA為模板，然后分別以IDP7818和IDP7635為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得的大小分別為410bp和230bp的特異片段。

上述培育低植酸玉米品種的方法中所述的具有低植酸基因lpa319的玉米品種可以是齊319或帶有低植酸基因lpa319的衍生系。上述培育低植酸玉米品種的方法中所述的農(nóng)藝性狀優(yōu)良屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的概念。利用上述玉米低植酸基因的分子標(biāo)記培育低植酸玉米品種的回交育種方法，包括以帶有低植酸基因lpa319的玉米自交系為非輪回親本，以另一不帶有低植酸基因的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的自交系為輪回親本進(jìn)行雜交和回交，在回交后代中選擇同時(shí)帶有低植酸基因lpa319的兩個(gè)分子標(biāo)記、并且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的植株；重復(fù)回交4-5次，最后對(duì)于同時(shí)具有2個(gè)分子標(biāo)記的后代，再自交I次，即可獲得低植酸基因lpa319純合的新的低植酸玉米自交系；所述的兩個(gè)分子標(biāo)記是在以苗期提取的葉片總DNA為模板，分別以IDP7818和IDP7635為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得的大小分別為410bp和230bp的特異片段。上述方法中所述的帶有低植酸基因lpa319的玉米自交系是指齊319或帶有低植酸基因lpa319的衍生系。上述育種方法中所述的農(nóng)藝性狀優(yōu)良屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的概念。本發(fā)明用于擴(kuò)增上述玉米低植酸基因的分子標(biāo)記的引物對(duì)，所述的引物對(duì)分別為IDP7818和IDP7635，其中引物對(duì)IDP7818由SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的核苷酸序列組成；引物對(duì)IDP7635由SEQ ID No 3和SEQ ID No :4所示的核苷酸序列組成。含有上述玉米低植酸基因分子標(biāo)記的檢測(cè)試劑盒，包括用于PCR擴(kuò)增的引物對(duì)IDP7818和IDP7635 ;其中引物對(duì)IDP7818由SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的核苷酸序列組成；引物對(duì)IDP7635由SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示的核苷酸序列組成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為(I)、本發(fā)明玉米低植酸基因的分子標(biāo)記為在分子水平上對(duì)玉米低植酸性狀進(jìn)行輔助選擇提供了有效手段，利用本發(fā)明的分子標(biāo)記對(duì)玉米低植酸基因進(jìn)行選擇準(zhǔn)確可靠；(2)、與現(xiàn)有技術(shù)相比，利用本發(fā)明的分子標(biāo)記可對(duì)育種的后代的低植酸基因直接進(jìn)行選擇，不必像傳統(tǒng)方法那樣需要自交使隱性性狀表達(dá)后再進(jìn)行選擇，因而利用本發(fā)明分子標(biāo)記具有育種周期短、育種效率高等優(yōu)點(diǎn)；
(3)、本發(fā)明分子標(biāo)記選擇僅是進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可直接在在分子水平上進(jìn)行選擇，方法簡單快速，成本低，適于在育種中大規(guī)模群體選擇應(yīng)用；而傳統(tǒng)方法則需要對(duì)籽粒進(jìn)行進(jìn)行染色鑒定，方法繁瑣、準(zhǔn)確性差、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高，育種規(guī)模受到限制。


圖1.為用引物對(duì)IDP7818進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的電泳圖譜；其中I為Marker ；2為齊 319 ；3 為 Lpa241 ；4 為 F1 代。圖2.用引物對(duì)IDP7635進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的電泳圖譜；其中I為Marker ；2為齊319 ；3 為 Lpa241 ；4 為 F1 代。圖3.為用引物對(duì)IDP7818進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得&個(gè)體的電泳圖譜；其中I為齊319，2為Lpa241，3 15為F2個(gè)體。圖4.為用引物對(duì)IDP7635進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得&個(gè)體的電泳圖譜；其中I為齊319，2為Lpa241，3 15為F2個(gè)體。

圖5.為低植酸基因lpa319與分子標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置不意圖。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但是對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍不構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1玉米低植酸F2分離群體的構(gòu)建及低植酸性狀遺傳分析按照如下方法進(jìn)行(I)在河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米試驗(yàn)田中以自交系Lpa241 (Lpa241不含低植酸基因)為母本，以低植酸自交系齊319為父本雜交，收獲得F1代種子；(2)次年種植F1代并套袋自交，獲得F2代種子；(3)對(duì)&代種子采用鑰酸銨定磷比色法檢測(cè)無機(jī)磷含量，確定低植酸的個(gè)體；用X 2 = E (實(shí)得數(shù)-預(yù)期數(shù))2/預(yù)期數(shù)檢驗(yàn)F2代群體的分離結(jié)果；統(tǒng)計(jì)分析依據(jù)《遺傳學(xué)》(劉祖洞.1999，遺傳學(xué).北京高等教育出版社)中的方法進(jìn)行。鑰酸銨定磷比色法測(cè)定玉米籽粒的無機(jī)磷含量的方法為取待測(cè)籽粒，按單粒稱重，磨碎(留一部分用于提取總DNA)，置于96孔V型酶標(biāo)板，然后按樣品質(zhì)量每毫克加入10 ii L的0. 4mol/L鹽酸，4°C下過夜提取，次日取提取液10 y L于新的酶標(biāo)板，加入蒸餾水90 ii L和新鮮配制的顯色劑(3mol/L濃硫酸2.5% (W/V)的鑰酸銨10% (W/V)的抗壞血酸蒸餾水=1:1 :1 : 2) IOOy L，室溫下靜置lh，然后進(jìn)行比色測(cè)定；每個(gè)酶標(biāo)板上設(shè)置5個(gè)用磷酸氫二鉀配制的標(biāo)準(zhǔn)磷,容積均為200 u L,含磷量分別為0 ii g、0. 15 u g、0. 46 u g、0. 93y g和1. 39 u g,顯色后呈現(xiàn)不同深度的藍(lán)色,與標(biāo)準(zhǔn)磷樣品的顏色對(duì)比，可對(duì)F2代種子的無機(jī)磷含量進(jìn)行定性檢測(cè)。通過對(duì)8個(gè)F1后代的2184個(gè)F2代籽粒進(jìn)行鑰酸銨顯色分析，發(fā)現(xiàn)有509個(gè)籽粒表現(xiàn)高無機(jī)磷(低值酸)性狀，其余1675個(gè)籽粒表現(xiàn)低無機(jī)磷性狀(表I)。經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)表明，F(xiàn)2代的分離符合3 I的分離比例，單獨(dú)對(duì)不同F(xiàn)1后代的F2籽粒分別進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)，也都符合3 I的比率，說明該低植酸性狀受單一隱性基因的控制。表I F2代籽粒低植酸性狀檢測(cè)和遺傳分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.玉米低植酸基因的分子標(biāo)記，其特征在于所述的分子標(biāo)記為兩個(gè)，擴(kuò)增該2個(gè)分子標(biāo)記的引物對(duì)分別為IDP7818和IDP7635，其中引物對(duì)IDP7818由SEQ ID No 1和SEQ IDNo :2所示的核苷酸序列組成，引物對(duì)IDP7635由SEQ ID No :3和SEQ ID No :4所示的核苷酸序列組成。
2.按照權(quán)利要求1所述的玉米低植酸基因的分子標(biāo)記，其特征在于所述的玉米低植酸基因?yàn)閘pa319。
3.按照權(quán)利要求1所述的玉米低植酸基因的分子標(biāo)記，其特征在于利用引物對(duì)IDP7818進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的特異片段大小為410bp。
4.按照權(quán)利要求1所述的玉米低植酸基因的分子標(biāo)記，其特征在于利用引物對(duì)IDP7635進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的特異片段大小為230bp。
5.權(quán)利要求1所述的玉米低植酸基因的分子標(biāo)記在低植酸玉米育種上的應(yīng)用；所述的低植酸基因是lpa319。
6.利用權(quán)利要求1所述的低植酸基因的分子標(biāo)記培育低植酸玉米品種的方法，其特征在于包括以具有低植酸基因lpa319的玉米品種為親本之一，通過回交、雜交或組織培養(yǎng)的方法培育低植酸玉米自交系，主要是在后代中選擇同時(shí)具有低植酸基因lpa319的兩個(gè)分子標(biāo)記、并且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的后代，連續(xù)進(jìn)行4-5代，即可獲得低植酸玉米自交系；其中所述的兩個(gè)分子標(biāo)記是在苗期提取的葉片總DNA為模板，然后分別以IDP7818和IDP7635為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得的大小分別為410bp和230bp的特異片段。
7.按照權(quán)利要求6所述的培育低植酸玉米品種的方法，其特征在于所述的具有低植酸基因lpa319的玉米品種是齊319或帶有低植酸基因lpa319的衍生系。
8.利用權(quán)利要求1所述的玉米低植酸基因的分子標(biāo)記培育低植酸玉米品種的回交育種方法，其特征在于包括以帶有低植酸基因lpa319的玉米自交系為非輪回親本，以另一不帶有低植酸基因的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的自交系為輪回親本進(jìn)行雜交和回交，在回交后代中選擇同時(shí)帶有低植酸基因lpa319的兩個(gè)分子標(biāo)記、并且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的植株；重復(fù)回交4-5次，最后對(duì)于同時(shí)具有2個(gè)分子標(biāo)記的后代，再自交I次，即可獲得低植酸基因lpa319純合的新的低植酸玉米自交系；所述的兩個(gè)分子標(biāo)記是在以苗期提取的葉片總DNA為模板，分別以IDP7818和IDP7635為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得的大小分別為410bp和230bp的特異片段。
9.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的玉米低植酸基因的分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于所述的引物對(duì)分別為IDP7818和IDP7635，其中引物對(duì)IDP7818由SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的核苷酸序列組成；引物對(duì)IDP7635由SEQID No :3和SEQ ID No :4所示的核苷酸序列組成。
10.一種玉米低植酸基因分子標(biāo)記的檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括用于PCR擴(kuò)增的引物對(duì)IDP7818和IDP7635 ;其中引物對(duì)IDP7818由SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的核苷酸序列組成；引物對(duì)IDP7635由SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示的核苷酸序列組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于作物分子標(biāo)記領(lǐng)域的玉米低植酸基因的兩個(gè)分子標(biāo)記，擴(kuò)增該兩個(gè)分子標(biāo)記的引物對(duì)分別為IDP7818和IDP7635，其中引物對(duì)IDP7818由SEQ ID No1和SEQ ID No2所示的核苷酸序列組成；引物對(duì)IDP7635由SEQ ID No3和SEQ ID No4所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明還公開了利用低植酸基因的分子標(biāo)記培育低植酸玉米品種的方法以及檢測(cè)試劑盒等。本發(fā)明玉米低植酸基因的分子標(biāo)記為對(duì)玉米低植酸性狀進(jìn)行輔助選擇提供了有效手段，選擇結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并且育種周期短、育種效率高；此外，利用分子標(biāo)記輔助選擇方法簡單、成本低，適于進(jìn)行大規(guī)模的育種后代選擇。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103060314SQ201210391319
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者劉國振, 高慶華, 孟義江, 劉麗娟, 賈盟, 張萃, 竇世娟, 李莉云, 蘭金蘋, 魏健 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)