專利名稱：環(huán)境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境水體質(zhì)量的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法。
背景技術(shù)：
腸道病毒是廣泛存在于水源水及污染水中，不斷引起水媒病毒傳染病的暴發(fā)流行。病毒的檢測方法主要有組織培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等。其中，組織培養(yǎng)法培養(yǎng)周期長，有些病毒缺乏敏感的細(xì)胞系來培養(yǎng)或無明顯細(xì)胞病變效應(yīng)；免疫學(xué)檢測方法需要較高濃度的病毒樣品，環(huán)境水樣濃縮后，也不易達到所需濃度；分子生物學(xué)方法多利用核酸的檢測，因其檢測時間短，檢測限低靈敏度高，精確度高，已得到廣泛的應(yīng)用。環(huán)境水體中腸道病毒屬宿主迥異，種類復(fù)雜濃度低，現(xiàn)有的關(guān)于環(huán)境水體中腸道 病毒的PCR檢測方法大多是定性或定量的檢測總腸道病毒，來源于人類分泌物或排泄物的腸道病毒的檢測很少有研究涉及。因環(huán)境水體水質(zhì)復(fù)雜同時存在很多PCR反應(yīng)抑制劑和其他雜質(zhì)，導(dǎo)致現(xiàn)有檢測方法存在靈敏度不夠高、受雜質(zhì)干擾影響較大、無法準(zhǔn)確定量的缺點。目前還沒有科學(xué)的用于對環(huán)境水體中人類腸道病毒和非人類腸道病毒含量進行檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種環(huán)境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法。為此，本發(fā)明提供的環(huán)境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法按下述步驟進行步驟一,樣品處理(I)樣品米集米集待檢測水樣后于4 C條件下保存；(2)病毒濃縮于V mL的待檢測水樣中加入質(zhì)量百分比為8%的聚乙二醇(PEG-6000)和質(zhì)量百分比為2. 3%的氯化鈉(NaCl);接著將待檢測水樣在100rpm、4°C條件下攪拌12小時；然后將待檢測水樣在9000g，4°C條件下離心30分鐘，棄上清液，用ImL超純水重懸沉淀得到病毒濃縮液，其中50 < V < 250 ;(3) RNA提取使用RNA提取試劑盒從病毒濃縮液中提取RNA ；(4)逆轉(zhuǎn)錄將5 μ L 的RNA、2 μ L 的 5xgDNA Eraser Buffer、I μ L 的 5xgDNA EraserBuffer和2 μ L的RNase Free dH20在42°C條件下反應(yīng)2min得到反應(yīng)液，將該反應(yīng)液與4 μ L 的5xPrimeScript* Buffer> I μ L 的PrinieScript**' RT Enzyme Mix、I μ L 的 RT PrimerMix和4 μ L的RNase Free dH20混合進行如下反應(yīng)先在37°C條件下反應(yīng)15min ;接著在85°C條件下反應(yīng)5s ;得到cDNA，并將所得cDNA在_80°C條件下保存；步驟二，標(biāo)準(zhǔn)品制備(I)第一輪PCR擴增以步驟一獲得的cDNA為模板，利用上游引物EVR-Fl和下游引物EVR-Rl進行PCR擴增，得到第一輪擴增后的PCR產(chǎn)物，其中
上游引物EVR-Fl的核苷酸序列為5’ -CCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’ ；下游引物EVR-Rl的核苷酸序列為5， -CAATTGTCACCATAAGCAGCCA-3，；(2 )第二輪PCR擴增以第一輪擴增后的PCR產(chǎn)物為模板，利用上游引物EVR-F2和下游引物EVR-R2進行PCR擴增，得到第二輪擴增后的PCR產(chǎn)物，其中上游引物EVR-F2的核苷酸序列為5， -GTAACGGGCAACTCTGCAGC-3，；下游引物EVR-R2的核苷酸序列為 5， -ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3，；(3)將所得的第二輪擴增后的PCR產(chǎn)物電泳膠純化回收目的片段，得到目的片段產(chǎn)物，該目的片段產(chǎn)物的長度為m (bp)；(4)首先將目的片段產(chǎn)物與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，篩選出轉(zhuǎn)化進插入目的片段的載體的菌落，將該陽性菌在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C條件下培養(yǎng)12 16小時得到菌液，其中卡那霉素的質(zhì)量濃度為50μ g/mL ;然后用質(zhì)粒提取試劑盒從菌液中提取質(zhì)粒；接著采用雙脫氧終止法對得到的質(zhì)粒的核苷酸序列進行測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經(jīng)BLAST比對，當(dāng)所測得的核苷酸序列與人類腸道病毒基因相似度大于等于90%時，提取的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品；當(dāng)所測得的核酸序列與人類腸道病毒基因相似度小于90%時，重復(fù)步驟(4)，直至提取的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品；(5 )檢測標(biāo)準(zhǔn)品的OD26tl值η ；(6)利用(式I)計算標(biāo)準(zhǔn)品濃度C (copies/ μ L)
權(quán)利要求
1.一種環(huán)境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法，其特征在于，方法按下述步驟進行 步驟一，樣品處理 (1)樣品米集米集待檢測水樣后于4C條件下保存； (2)病毒濃縮于VmL的待檢測水樣中加入質(zhì)量百分比為8%的聚乙二醇(PEG-6000)和質(zhì)量百分比為2. 3%的氯化鈉(NaCl);接著將待檢測水樣在100rpm、4°C條件下攪拌12小時；然后將待檢測水樣在9000g，4°C條件下離心30分鐘，棄上清液，用ImL超純水重懸沉淀得到病毒濃縮液，其中50≤V≤250 ; (3)RNA提取使用RNA提取試劑盒從病毒濃縮液中提取RNA ；(4)逆轉(zhuǎn)錄將5 μ L 的 RNA、2 μ L 的 5X gDNA Eraser Buffer、I μ L 的 5X gDNA EraserBuffer和2 μ L的RNase Free dH20在42°C條件下反應(yīng)2min得到反應(yīng)液，將該反應(yīng)液與.4 μ L 的5XPrimeSerifJt* Buffer、I μ L 的PrimeScript RT Enzyme Mix、I μ L 的 RT PrimerMix和4 μ L的RNase Free dH20混合進行如下反應(yīng)先在37°C條件下反應(yīng)15min ;接著在85°C條件下反應(yīng)5s ;得到cDNA，并將所得cDNA在_80°C條件下保存； 步驟二，標(biāo)準(zhǔn)品制備 (1)第一輪PCR擴增以步驟一獲得的cDNA為模板，利用上游引物EVR-Fl和下游引物EVR-Rl進行PCR擴增，得到第一輪擴增后的PCR產(chǎn)物，其中 上游引物EVR-Fl的核苷酸序列為5’ -CCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’ ； 下游引物EVR-Rl的核苷酸序列為5’ -CAATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ ； (2)第二輪PCR擴增以第一輪擴增后的PCR產(chǎn)物為模板，利用上游引物EVR-F2和下游引物EVR-R2進行PCR擴增，得到第二輪擴增后的PCR產(chǎn)物，其中 上游引物EVR-F2的核苷酸序列為5’ -GTAACGGGCAACTCTGCAGC-3’ ； 下游引物EVR-R2的核苷酸序列為5’ -ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ ； (3)將所得的第二輪擴增后的PCR產(chǎn)物電泳膠純化回收目的片段，得到目的片段產(chǎn)物，該目的片段產(chǎn)物的長度為m (bp)； (4)首先將目的片段產(chǎn)物與PMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，篩選出轉(zhuǎn)化進插入目的片段的載體的菌落，將該陽性菌在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C條件下培養(yǎng)12 16小時得到菌液，其中卡那霉素的質(zhì)量濃度為50μ g/mL ;然后用質(zhì)粒提取試劑盒從菌液中提取質(zhì)粒；接著采用雙脫氧終止法對得到的質(zhì)粒的核苷酸序列進行測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經(jīng)BLAST比對，當(dāng)所測得的核苷酸序列與人類腸道病毒基因相似度大于等于90%時，提取的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品；當(dāng)所測得的核酸序列與人類腸道病毒基因相似度小于90%時，重復(fù)步驟(4)，直至提取的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品； (5)檢測標(biāo)準(zhǔn)品的OD26tl值η; (6)利用(式I)計算標(biāo)準(zhǔn)品濃度C(copies/ μ L)
2.如權(quán)利要求I所述的環(huán)境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法，其特征在于，步驟二(5)中標(biāo)準(zhǔn)品的OD26tl值采用微量紫外分光光度計檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種環(huán)境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒的含量檢測方法。在已建立環(huán)境水體中腸道病毒定量檢測方法的基礎(chǔ)上，選擇針對人類腸道病毒的引物和探針，制備重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了定量檢測人類腸道病毒的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，定量檢測環(huán)境水體中的人類腸道病毒含量和腸道病毒含量，進一步確定非人類腸道病毒的分布情況。該方法具有良好的特異性，靈敏度高，可對人類腸道病毒，腸道病毒進行準(zhǔn)確定量并確立環(huán)境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒的關(guān)系。
文檔編號C12Q1/68GK102888469SQ20121039271
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者周進宏, 王曉昌, 張崇淼, 船水尚行, 佐野大輔 申請人:西安建筑科技大學(xué)