專利名稱：檢測水稻品種密陽46高硅含量等位基因qHUS6的特異性PCR分子標記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水稻育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測水稻品種密陽46高硅含量等位基因qHUS6的特異性PCR分子標記。
背景技術(shù)：
水稻是典型的吸硅作物，硅在水稻生長發(fā)育過程中具有重要作用。高硅水稻品種在生長過程中可有效減輕各種生物和非生物協(xié)迫，改善對稻瘟病和紋枯病的抗性，提高抗倒伏能力與抗旱性。高硅水稻品種的培育一般通過應(yīng)用高硅水稻材料、采用雜交選育獲得，而硅在水稻中特別是穎殼中的含量須在水稻成熟收獲后才能檢測，無法通過傳統(tǒng)的田間表型觀察進行選擇。 隨著分子標記的快速發(fā)展，借助分子標記輔助選擇，可以在任ー階段檢測控制硅含量的基因，鑒定對硅積累增效的等位基因是否已導(dǎo)入受體品種，選育高硅水稻品種。分子標記輔助選擇育種的開展需具備三個條件
(1)供體未本攜帶效應(yīng)明確、已精細定位或克隆的目標基因；
(2)已開發(fā)出與目標基因緊密連鎖且檢測簡便的標記；
(3)連鎖標記在供體和受體親本之間呈多態(tài)。前期研究表明，在水稻第6染色體上克隆了一個控制水稻硅含量的ヴ規(guī)/洛基因，其增效等位基因來源于水稻品種密陽46。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上對^M/洛基因及其緊密連鎖區(qū)間進行測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計基因功能和序標位(STS)標記，并從中挑選出可特異性鑒定密陽46等位基因的標記。本發(fā)明提供的分子標記對密陽46中高硅含量等位基因qHUS6的檢測具有普遍應(yīng)用價值，可以廣泛地應(yīng)用于密陽46高硅含量等位基因_S6的轉(zhuǎn)育研究中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了 16個檢測水稻品種密陽46高硅含量等位基因QHUS6的特異性分子標記。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
根據(jù)前期的K依的克隆結(jié)果，對基因及其緊密連鎖區(qū)間進行測序，將測序結(jié)果與已公布的梗稻品種Nipponbare和軸稻品種93-11的基因組序列進彳丁比對，根據(jù)目標序列的摘入和缺失情況，設(shè)計了 53個與qHUS6緊密連鎖的STS標記。將這53個STS標記用于檢測定位群體親本珍汕97B和密陽46，篩選出16個在水稻品種密陽46中檢測到特異片段的標記。這16個標記可用于鑒定待測材料是否在^M/洛座位上攜帯水稻品種密陽46控制水稻硅含量的等位基因。檢測水稻品種密陽46高硅含量等位基因^M/洛的特異性PCR分子標記，包含16個特異性標記 Si2925A、Si2925B、Si2926A、Si2926B、Si2927A、Si2927B、Si2927Cl、Si2927C2、Si2927C3、Si2933A、Si2933B、Si2933C、Si2936、Si2939、Si2940、Si2946 的引物各ー對Si2925A的上游引物序列為5’ -TTGGCTAGCTTAACCTTCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: I所示的核苷酸序列；Si2925A的下游引物序列為5’ -GGCCATGTCAAATTAATAACCTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
Si2925B的上游引物序列為5’ -CATCTGTGTCACTGTTTGGCT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列；Si2925B的下游引物序列為5’ -GGCCATGTCAAATTAATAACCTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
Si2926A的上游引物序列為5’ -TACGGATCATATCTTGGATGC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；Si2926A的下游引物序列為5’ -TAACATATCTGATCGGTGCCTA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
Si2926B的上游引物序列為5’ -TACGGATCATATCTTGGATGC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 7的所示核苷酸序列；Si2926B的下游引物序列為5’-ACCAGGAATATCGGTGACCA-3’，所述 核苷酸序列為SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列；
Si2927A的上游引物序列為5’-AGACCTGCCTAGCTGT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:9的所示核苷酸序列；Si2927A的下游引物序列為5’-AAAATGTTTGGCTAGCTTATGAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列；
Si2927B的上游引物序列為5’ -CATGCAGGCTCTTAAGTGT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 11的所示核苷酸序列；Si2927B的下游引物序列為5’ -AAAATGTTTGGCTAGCTTATGAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列；
Si2927Cl 的上游引物序列為 5’-AACATGAGAAAATAACTTGCACAT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 13的所示核苷酸序列；Si2927Cl的下游引物序列為5’-TCATTCTGATAGCTTTGTCCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列；Si2927C2的上游引物序列為5’-AACATGAGAAAATAACTTGCACAT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 15的所示核苷酸序列；Si2927C2的下游引物序列為5’ -CCGTCATCGCCCGTTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列；
Si2927C3的上游引物序列為5’ -AACTTGGGACAAAGCTATCAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQID NO: 17的所示核苷酸序列；Si2927C3的下游引物序列為5’ -CCGTCATCGCCCGTTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列；
Si2933A的上游引物序列為5’ -AGACGCTCATATTCAACAC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 19的所示核苷酸序列；Si2933A的下游引物序列為5’-TAAAGCGCAATCAGACT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:20所示的核苷酸序列；
Si2933B的的上游引物序列為5’-AGTACTACATACCCCTATCCAC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:21的所示核苷酸序列；Si2933B的下游引物序列為5’-AATATATGTATAGACCACGCGCACT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；
Si2933C 的上游引物序列為 5’-GAAAATATATACTAGCAATCCTCGCAAA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 23的所示核苷酸序列；Si2933C的下游引物序列為5’-CATAGGCTTGCATCCAGACTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列；Si2936 的上游引物序列為 5’-AAACTTAAAGAAAITTGACTATGAAA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 25的所示核苷酸序列；Si2936的下游引物序列為5’-AACAAGATCTGATCAACTTCAC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列；
512939的上游引物序列為 5’-GGTAAATTGTCTTTCCATACTAITG-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 27的所示核苷酸序列；Si2939的下游引物序列為5’-AATTATTTGGAGGAGCGTATC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列；
512940的上游引物序列為 5’-ACACTCAITTCAAGAITCAACTT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 29的所示核苷酸序列；Si2940的下游引物序列為5’ -GCCAATATAAACAAGGTTACTACTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；
Si2946的上游引物序列為5’ -ATGCCMTTGAGTTTCGTTCAC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO:31的所示核苷酸序列；Si2946的下游引物序列為5’ -CATGACATCGACGCGAAGT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列。 16 個標記的 PCR 擴增均采用如下體系Tris-HCL(pH 8. 8)33. 5 mM, (NH4)2SO4 8. 0mM，MgCl2 I. 5 mM, TWEEN-20 0. 05%, dNTPs 0. 2 mM，上、下游引物各 3. 3 ng/m, Taq DNA 聚合酶2.0單位，模版DNA 50 ng。PCR反應(yīng)條件除退火溫度外其它一致，具體參數(shù)為94°C2 分鐘；94°C 45 秒、50-60。。(Si2940 為 60°C，Si2939 和 Si2946 為 55°C，其余 13 個標記皆為50°C ) 45秒、72°C I分鐘，30個循環(huán)；72°C 8分鐘。四

圖I為Si2926A對192個分離材料的檢測結(jié)果圖。其中，M:分子量標記；ZS :珍汕 97B ；MY :密陽 46 ;S1、S2、S3、S4、S8、S9、S13、S15、S17、S18、S19、S20、S21、S27、S29、S32、S33、S34、S36、S40 為篩選出的 20 個呈珍汕 97B 純合型的單株；S5、S6、S7、S10、Sll、S12、S14、S16、S22、S23、S24、S25、S26、S28、S30、S31、
S35、S37、S38、S39為篩選出的20個呈密陽46純合型的單株。圖2為40個純合型株系的硅含量檢測結(jié)果圖。其中，，縱坐標為硅百分含量，橫坐標為株系；20個珍汕97B純合型株系(SI、S2、S3、S4、S8、S9、S13、S15、S17、S18、S19、S20、S21、S27、S29、S32、S33、S34、S36、S40)(硅含量用未填充的柱狀圖表示)的硅含量顯著0° < 0. 01)低于20個密陽46純合型株系(S5、S6、S7、S10、Sll、S12、S14、S16、S22、S23、S24、S25、S26、S28、S30、S31、S35、S37、S38、S39)(硅含量用黒色填充的柱狀圖表示)。五具體實施例方式 I、密陽46高硅含量等位基因_S6的特異性PCR分子標記的篩選根據(jù)前期的克隆結(jié)果，對的漢依及其緊密連鎖區(qū)間進行測序，將測序結(jié)果與已公布的粳稻品種日本睛和秈稻品種93-11序列進行比對，分析日本睛和93-11序列間的插入和缺失，設(shè)計了沿ヤqHUS6功能標記及緊密連鎖的STS標記，應(yīng)用下述步驟檢測定位群體親本珍汕97B和密陽46，篩選出16個在密陽46檢測到特異片段的標記。(I)DNA提取將珍汕97B和密陽46的種子分別置于預(yù)先標號的培養(yǎng)皿，30°C發(fā)芽7天，采用簡易法從幼苗中提取DNA。(2) PCR擴增采用20 W反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如上所述，在PCR儀上進行擴增。(3) PCR產(chǎn)物電泳及顯色擴增產(chǎn)物中加入加樣緩沖液，每樣品取2 m上樣于6%非變性聚丙烯酰胺膠(PAGE);接通電極，在IOOV恒定電壓下電泳4小吋，關(guān)閉電源；取下凝膠，銀染顯色。如圖I所示所篩選出的標記能從分離群體中篩選攜帯^M/洛不同等位基因的單株，其中，SI、S2、S3、S4、S8、S9、S13、S15、S17、S18、S19、S20、S21、S27、S29、S32、S33、S34、
S36、S40 表現(xiàn)為珍汕 97B 純合型，S5、S6、S7、S10、SlU S12、S14、S16、S22、S23、S24、S25、S26、S28、S30、S31、S35、S 37、S38、S39 表現(xiàn)為密陽 46 純合型。2、特異性PCR標記對密陽46高硅含量等位基因_S6鑒定效果的驗證
收獲40個獲選單株上的種子，2010年在中國水稻研究所實驗基地以株系種植，設(shè)2個重復(fù)。成熟后每個重復(fù)每個株系取中間5株的谷粒于55°C - 60°C烘48小時，經(jīng)壟谷機對谷粒脫殼，并將谷殼置于55°C - 60°C烘干處理24小時，然后用旋風(fēng)磨粉儀對谷殼進行打磨，并將磨制的粉樣放置于60°C烘箱烘干至恒重，最后采用鑰藍比色法測定各樣品的硅含量，単位為％。每樣品測兩次，取平均值。從圖I、圖2結(jié)果顯示，基因型鑒定和硅含量檢測結(jié)果完全一致，20個珍汕97B純合型株系的硅含量(硅含量用未填充的柱狀圖表示)顯著Gd < 0. 01)低于20個密陽46純合型的株系(硅含量用黒色填充的柱狀圖表示)。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的分子標記可有效地檢測材料是否攜帶密陽46的高硅含量等位基因qHUS6。
權(quán)利要求
1.檢測水稻品種密陽46高硅含量等位基因_S6的特異性PCR分子標記，包含16個特異性標記 Si2925A、Si2925B、Si2926A、Si2926B、Si2927A、Si2927B、Si2927Cl、Si2927C2、Si2927C3、Si2933A、Si2933B、Si2933C、Si2936、Si2939、Si2940、Si2946 的引物各ー對Si2925A的上游引物序列為5’ -TTGGCTAGCTTAACCTTCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: I所示的核苷酸序列；Si2925A的下游引物序列為5’ -GGCCATGTCAAATTAATAACCTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； Si2925B的上游引物序列為5’ -CATCTGTGTCACTGTTTGGCT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列；Si2925B的下游引物序列為5’ -GGCCATGTCAAATTAATAACCTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； Si2926A的上游引物序列為5’ -TACGGATCATATCTTGGATGC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 5所示的核苷酸序列；Si2926A的下游引物序列為5’ -TAACATATCTGATCGGTGCCTA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； Si2926B的上游引物序列為5’ -TACGGATCATATCTTGGATGC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 7的所示核苷酸序列；Si2926B的下游引物序列為5’-ACCAGGAATATCGGTGACCA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列； Si2927A的上游引物序列為5’-AGACCTGCCTAGCTGT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列；Si2927A的下游引物序列為5’-AAAATGTTTGGCTAGCTTATGAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列； Si2927B的上游引物序列為5’ -CATGCAGGCTCTTAAGTGT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 11的所示核苷酸序列；Si2927B的下游引物序列為5’ -AAAATGTTTGGCTAGCTTATGAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列； Si2927Cl 的上游引物序列為 5’-AACATGAGAAAATAACTTGCACAT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 13的所示核苷酸序列；Si2927Cl的下游引物序列為5’-TCATTCTGATAGCTTTGTCCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列；Si2927C2的上游引物序列為5’-AACATGAGAAAATAACTTGCACAT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 15的所示核苷酸序列；Si2927C2的下游引物序列為5’ -CCGTCATCGCCCGTTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列； Si2927C3的上游引物序列為5’ -AACTTGGGACAAAGCTATCAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQID NO: 17的所示核苷酸序列；Si2927C3的下游引物序列為5’ -CCGTCATCGCCCGTTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列； Si2933A的上游引物序列為5’ -AGACGCTCATATTCAACAC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 19的所示核苷酸序列；Si2933A的下游引物序列為5’ -TAAAGCGCAATCAGACT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:20所示的核苷酸序列； Si2933B的的上游引物序列為5’-AGTACTACATACCCCTATCCAC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:21的所示核苷酸序列；Si2933B的下游引物序列為5’-AATATATGTATAGACCACGCGCACT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列； Si2933C 的上游引物序列為 5’-GAAAATATATACTAGCAATCCTCGCAAA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 23的所示核苷酸序列；Si2933C的下游引物序列為5’-CATAGGCTTGCATCCAGACTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列； Si2936 的上游引物序列為 5’-AAACTTAAAGAAAITTGACTATGAAA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 25的所示核苷酸序列；Si2936的下游引物序列為5’-AACAAGATCTGATCAACTTCAC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列； 512939的上游引物序列為 5’-GGTAAATTGTCTTTCCATACTAITG-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 27的所示核苷酸序列；Si2939的下游引物序列為5’-AATTATTTGGAGGAGCGTATC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列； 512940的上游引物序列為 5’-ACACTCAITTCAAGAITCAACTT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 29的所示核苷酸序列；Si2940的下游引物序列為5’ -GCCAATATAAACAAGGTTACTACTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 30所示的核苷酸序列；Si2946的上游引物序列為5’ -ATGCCAATTGAGTTTCGTTCAC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO:31的所示核苷酸序列；Si2946的下游引物序列為5’ -CATGACATCGACGCGAAGT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測水稻品種密陽46高硅含量等位基因qHUS6的16個特異性PCR分子標記，分別為Si2925A、Si2925B、Si2926A、Si2926B、Si2927A、Si2927B、Si2927C1、Si2927C2、Si2927C3、Si2933A、Si2933B、Si2933C、Si2936、Si2939、Si2940、Si2946的PCR引物。利用這16個標記對水稻苗期所提取的DNA進行鑒定，可以檢測待測材料是否轉(zhuǎn)入水稻品種密陽46的高硅含量等位基因qHUS6，即是否具有提高水稻硅含量的能力，整個檢測過程操作簡單且準確性高。
文檔編號C12Q1/68GK102864245SQ20121039283
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者應(yīng)杰政, 樊葉楊, 莊潔云, 朱玉君 申請人:中國水稻研究所