專利名稱：一種風(fēng)疹病毒rt-pcr熒光檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種風(fēng)疹病毒RT-PCR熒光檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
(ニ)
背景技術(shù)：
風(fēng)疹是由風(fēng)疹病毒(Rubella virus，RV)感染引起的急性出疹性呼吸道傳染病。婦女在妊振的前3個(gè)月感染RV易引起胎兒先天性風(fēng)疫綜合癥(Congenital RubellaSyndromes, CRS)，導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)、胎兒畸形智力低下等。在臨床癥狀上，RV引起的風(fēng)疹與輕型麻疹以及ー些腸道病毒感染所引起的出疹性疾病不易區(qū)分。因此對(duì)于以優(yōu)生優(yōu)育為目的的產(chǎn)前診斷或臨床診斷來(lái)講，建立快速、敏感、準(zhǔn)確的 RV檢測(cè)方法是十分必要的。近年熒光PCR技術(shù)在病毒等微生物檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，它利用PCR技術(shù)對(duì)DNA的高效擴(kuò)增并結(jié)合探針技術(shù)的高特異性和敏感性，克服了常規(guī)血清學(xué)和普通PCR方法的不足，是ー種很有應(yīng)用價(jià)值的診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種風(fēng)疹感染實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測(cè)的風(fēng)疹病毒熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)試劑盒及方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種風(fēng)疹病毒RT-PCR熒光檢測(cè)試劑盒，主要包括RT-PCR反應(yīng)試劑以及特異性引物和探針，所述特異性引物和探針如下上游引物5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’下游引物5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’熒光探針FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1；其中，R為A或G，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性引物和探針的設(shè)計(jì)，試劑盒內(nèi)的其他組分，為本領(lǐng)域常規(guī)用于RT-PCR的試劑,如dNTP mix、MgCl2、buffer、酶等,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)常識(shí)進(jìn)行選擇，可自行配制，也可選用市購(gòu)商品，如Roche公司的RT-PCR system 1938823試劑盒
坐寸o本發(fā)明還涉及ー種利用所述檢測(cè)試劑盒檢測(cè)風(fēng)疹病毒的方法，所述方法包括(I)提取待測(cè)樣品RNA ;所述樣品RNA提取可按常規(guī)方法進(jìn)行，如采用德國(guó)QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取。(2)以待測(cè)樣品RNA為模板，加入特異性引物和探針，以及RT-PCR反應(yīng)試劑，配成RT-PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；所述特異性引物和探針如下上游引物5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’下游引物5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’熒光探針FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1；
其中，R為A或G，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)；(3)熒光RT-PCR檢測(cè)以Ct值< 37并且擴(kuò)增曲線呈S型為陽(yáng)性判定原則；其中Ct值〈35且擴(kuò)增曲線良好可直接判定為陽(yáng)性；Ct值在35 37之間需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)均能得到良好S型擴(kuò)增曲線方則判定為陽(yáng)性。所述擴(kuò)增反應(yīng)的條件為42°C 30min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，95°C 2min變性，然后94°C10s，60°C lmin，在60°C進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。RV能誘發(fā)急性呼吸道疾病，常在托幼機(jī)構(gòu)和中小學(xué)校中出現(xiàn)流行或爆發(fā)，嚴(yán)重危害青少年健康。傳統(tǒng)風(fēng)疹臨床檢驗(yàn)常用病毒分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和普通RT-PCR法等。病毒分離培養(yǎng)由于技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不適合用于早期快速診斷的需要。免疫學(xué)方法雖然操作簡(jiǎn)便，但其靈敏度較差，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。普通RT-PCR和巢式PCR方法，方法較為簡(jiǎn)便、敏感，但由于需進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，有容易發(fā)生交叉污染的缺點(diǎn)。近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)和高通量等優(yōu)點(diǎn)，已在病原體快速診斷中得到了較廣泛的應(yīng)用。·國(guó)內(nèi)有建立了熒光RT-PCR檢測(cè)RV方法，但敏感性僅IO3拷貝ル1，相對(duì)較低，且探針位點(diǎn)設(shè)置在RV的El基因區(qū)域，由于RV El基因容易變異常被用于風(fēng)疹基因的分型，目前變異已達(dá)8% 9%變異，該設(shè)計(jì)可能存在著實(shí)驗(yàn)的不確定性，容易使檢測(cè)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。本申請(qǐng)發(fā)明人從美國(guó)的NCBI基因庫(kù)上下載了世界各地的風(fēng)疹病毒毒株，對(duì)其進(jìn)行了同源性比較，在風(fēng)疹病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白P150基因保守區(qū)設(shè)計(jì)若干對(duì)引物與Taqman探針，對(duì)該區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)増，從中篩選出最佳的引物和探針，并對(duì)熒光RT-PCR方法進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證其敏感性、特異性和重復(fù)性。經(jīng)風(fēng)疹病毒Gos株、麻疹病毒滬191株、腮腺炎病毒TL株、呼吸道合胞病毒Long株以及流感病毒株與近期風(fēng)疹爆發(fā)疫情疑似患者含漱液樣本的檢測(cè)比較，該方法具有高特異性，只能檢出風(fēng)疹病毒，與麻疹、腮腺炎病毒、流感及其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，而且比常規(guī)RT-PCR和巢式PCR法更敏感、快速和簡(jiǎn)便。本方法從核酸堤取至完成檢測(cè)，僅需3 h左右，能同時(shí)完成多個(gè)疑似患者臨床樣本的高通量檢測(cè)，敏感度達(dá)0. 01 TCID50,比普通PT-PCR高100倍，比巢式PCR高10倍，可直接從風(fēng)疹患者的含漱液中檢測(cè)風(fēng)疹病毒核酸。此外，對(duì)同一病毒樣品進(jìn)行4次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果具有很好的重現(xiàn)性。用建立的新方法，對(duì)近期浙江省疑似風(fēng)疹爆發(fā)疫情疑似患者10份臨床樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室早期快速診斷，獲得了令人滿意的結(jié)果，為該病及時(shí)采取控制措施發(fā)揮了很好的作用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明試劑盒對(duì)風(fēng)疹病毒的檢測(cè)有高度的特異性，與麻疹、腮腺炎病毒、流感及其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)；本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的靈敏度達(dá)
0.OlTCID5tl，可直接從疑似風(fēng)疹患者的含漱液標(biāo)本中檢測(cè)風(fēng)疹病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測(cè)僅需3 h左右；本發(fā)明方法是ー種快速檢測(cè)風(fēng)疹病毒特異、敏感的方法，非常適用于風(fēng)疹病毒感染引起突發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室早期診斷。


圖I為熒光RT-PCR法檢測(cè)風(fēng)疹病毒的靈敏度結(jié)果；A E分別代表不同的病毒濃度，從 A 至 E 依次為 100、10、1、0. I ,0. OlTCID50 ；圖2為熒光RT-PCR法檢測(cè)對(duì)疑似風(fēng)疹患者臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :I材料與方法 I. I病毒株與臨床標(biāo)本風(fēng)疹病毒Gos株、麻疹病毒滬191株、腮腺炎病毒TL株以及呼吸道合胞病毒Long株，由上海生物制品研究所與中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。流感病毒株甲I/北京/56/97、甲3/悉尼/5/97、こ型/深圳/12/97由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。風(fēng)疹臨床疑似患者的標(biāo)本由浙江省各地市疾病預(yù)防控制中心在風(fēng)疫揚(yáng)發(fā)疫情中，米集疑似患者含漱液標(biāo)本送檢。I. 2引物與探針從美國(guó)GenBank下載不同年代與地區(qū)的20余株風(fēng)疹病毒全基因組序列，用生物學(xué)軟件軟件進(jìn)行同源性比較，在風(fēng)疹病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白P150基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，序列為Rubella-F :5’ -CCCAGCACTCCACGCAAT-3，Rubella-R :5’ -TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’Rubella-Pb FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQI引物和探針委托寶生物工程(大連)有限公司合成。I. 3病毒定量標(biāo)準(zhǔn)與病毒RNA的提取風(fēng)疹標(biāo)準(zhǔn)毒株采用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒效價(jià)滴定后(106 3TCID5(l/ml)作為參考株，將其稀釋至100、10、1、0. 1,0. 01,0. OOITCId50/管，分別提取RNA,病毒RNA提取采用德國(guó)QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取，得到病毒RNA，備用。1.4熒光RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化選用Roche公司的RT-PCR system 1938823試劑盒，按說(shuō)明書操作，反應(yīng)。各反應(yīng)物的終濃度為dNTP mix 0.2 mM、MgCl2 7.5 mM、Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合物0. 5W (5U/W)、模板RNA IOW、引物和探針濃度分別為0.8iiM與0.4iiM，最后用DEPC水補(bǔ)至25耵。用ABI 7500 Real Time PCR System 按下列參數(shù)進(jìn)行42°C逆轉(zhuǎn)錄 30min，95°C變性 2min，以 94°C 10s、60°C Imin 擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)，在
60 0C進(jìn)行單點(diǎn)突光檢測(cè)。結(jié)果判斷熒光RT-PCR檢測(cè)以Ct值< 37并且擴(kuò)增曲線呈S型為陽(yáng)性判定原則。其中Ct值〈35且擴(kuò)增曲線良好可直接判定為陽(yáng)性；Ct值在35 37之間需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)均能得到良好S型擴(kuò)增曲線方可判定為陽(yáng)性。體系的優(yōu)化試驗(yàn)，在以相同濃度陽(yáng)性核酸為模板的反應(yīng)體系中，選用不同濃度的引物和探針，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度與比例，根據(jù)最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度增加值(A Rn)選擇最佳引物和探針濃度。Mg2+的濃度高低對(duì)Taq酶的活性與擴(kuò)增的特異性密切相關(guān)，在同一反應(yīng)體系條件下改變Mg2+濃度，對(duì)Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。采用MJ Research0pticonTM2熒光定量PCR儀上的溫度梯度功能，在Tm值(48°C 62°C )下進(jìn)行檢測(cè)，選擇最佳Tm溫度。
1.5熒光RT-PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)選擇風(fēng)疹病毒Gos株、麻疹病毒滬191株、腮腺炎病毒TL株、呼吸道合胞病毒Long株以及流感病毒株與近期風(fēng)疹爆發(fā)疫情疑似患者含漱液樣本，對(duì)上述病毒株和樣本分別提取核酸，用風(fēng)疹病毒熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法的特異性；對(duì)已標(biāo)定TCID5tl的風(fēng)疹毒株稀釋后分別提取核酸，平行進(jìn)行熒光RT-PCR、RT-PCR反應(yīng)和巢式PCR法，比較其靈敏度。此外，對(duì)每ー個(gè)濃度的病毒稀釋液作4次重復(fù)檢測(cè)，得到的Ct值計(jì)算變異系數(shù)，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。2 結(jié)果·2. I熒光RT-PCR反應(yīng)體系及條件采用Roche公司的RT-PCR system 1938823試劑盒，反應(yīng)體系為25耵。優(yōu)化后的反應(yīng)體系Mg2+濃度為7. 5 mM, Tm溫度60°C，矩陣法優(yōu)選后引物探針的最佳濃度分別為0. 8剛和0.4剛。各反應(yīng)物的終濃度為dNTP mix 0.2 mM、MgCl2 7.5 mM、Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合物0. 5W (5U/W)、模板RNA IOW、引物和探針濃度分別為0. 8剛與0. 4剛，最后用DEPC水補(bǔ)至 251^1。用 ABI 7500 Real Time PCR System 按下列參數(shù)進(jìn)行42°C 逆轉(zhuǎn)錄 30min，95°C變性2min，以94°C 10s、60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在60°C進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。2. 2特異性試驗(yàn)本發(fā)明建立的熒光RT-PCR方法對(duì)風(fēng)疹病毒具有較好的特異性，麻疹、腮腺炎病毒、流感及其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。2. 3敏感性試驗(yàn)風(fēng)疹標(biāo)準(zhǔn)毒株采用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒效價(jià)滴定后(106. 3TCID50/ml)作為參考株，將其稀釋至100、10、1、0. 1、0. 01、0. OOITCId50/管，分別提取RNA，同時(shí)進(jìn)行熒光RT-PCR，普通RT-PCR和巢式PCR檢測(cè)(上下游引物均與熒光RT-PCR相同)。結(jié)果熒光RT-PCR方法敏感性可達(dá)0. 01 TCID5tl/管(見圖I),比普通PT-PCR高100倍，比巢式PCR高10倍(見表I)。表I :三種PCR方法檢測(cè)RV的靈敏度比較
古I病毒濃度(TCID5t,/管)
10010I0.10.01 0,01
熒光 RT-PCR Ct 值 22.9 26,33 29.7 33.18 36,47-
常規(guī)RT-PCR條帶 +++---
巢式PCR條帶++++--2. 4重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)已稀釋至100、10、1、0. 1、0. 01、0. OOITCId50/管的風(fēng)疹病毒濃度，分別作4次重
復(fù)檢測(cè)，得到的Ct值采用Microsoft Excel 2003計(jì)算變異系數(shù),結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測(cè)Ct值變異系數(shù)分別為0. 795%,0. 801%、0. 435%,0. 526%，表明檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性(表2)。表2 :突光RT-PCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種風(fēng)疹病毒RT-PCR熒光檢測(cè)試劑盒，主要包括RT-PCR反應(yīng)試劑以及特異性引物和探針，其特征在于所述特異性引物和探針如下 上游引物5’ -CCCAGCACTCCACGCAAT-3， 下游引物5’ -TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’ 熒光探針FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1 ； 其中，R為A或G，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)。
2.利用權(quán)利要求I所述檢測(cè)試劑盒檢測(cè)風(fēng)疹病毒的方法，所述方法包括 (1)提取待測(cè)樣品RNA; (2)以待測(cè)樣品RNA為模板，加入特異性引物和探針，以及RT-PCR反應(yīng)試劑，配成RT-PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)； 所述特異性引物和探針如下 上游引物5’ -CCCAGCACTCCACGCAAT-3’ 下游引物5’ -TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’ 熒光探針FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1 ； 其中，R為A或G，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)； (3)熒光RT-PCR檢測(cè)以Ct值<37并且擴(kuò)增曲線呈S型為陽(yáng)性判定原則；其中Ct值〈35且擴(kuò)增曲線良好可直接判定為陽(yáng)性；Ct值在35 37之間需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)均能得到良好S型擴(kuò)增曲線方則判定為陽(yáng)性。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述擴(kuò)增反應(yīng)的條件為42°C30min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，95°C 2min變性，然后94°C 10s，60°C lmin，在60°C進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種風(fēng)疹病毒RT-PCR熒光檢測(cè)試劑盒，主要包括RT-PCR反應(yīng)試劑以及特異性引物和探針，所述特異性引物和探針如下上游引物5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’下游引物5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’熒光探針FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1；本發(fā)明試劑盒對(duì)風(fēng)疹病毒的檢測(cè)有高度的特異性，與麻疹、腮腺炎病毒、流感及其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)；本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的靈敏度達(dá)0.01TCID50，可直接從疑似風(fēng)疹患者的含漱液標(biāo)本中檢測(cè)風(fēng)疹病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測(cè)僅需3 h左右，非常適用于風(fēng)疹病毒感染引起突發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室早期診斷 。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102952897SQ20121039434
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者徐昌平, 盧亦愚, 馮燕, 吳華森, 鐘淑玲 申請(qǐng)人:浙江省疾病預(yù)防控制中心