專利名稱：陽離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s-Cnim]Br₂在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及陽離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s_Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)的發(fā)展使疾病在分子水平上的基因治療成為可能。基因療法的整個過程為目的基因在載體的攜帶下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并實(shí)現(xiàn)基因修正和基因置換等，以糾正或補(bǔ)償基因缺陷和異常引起的疾病，或者通過干擾特定基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)治療的目的等(參見 Qasba, P. K.等人，DNA and Gene Therapy: Transfer of Mouse DNA to Humanand Mouse Embryonic Cells byPolyoma Pseudovirions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA1971，68，2345-2349 ;以及Xia, Η. B.等人，siRNA-mediated gene silencing in vitro an·din vivo, Nat. Biotechnol. 2002，20，1006-1010)，基因療法的關(guān)鍵問題之一便是如何將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)部，若單獨(dú)采用裸基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染，基因片段難于被細(xì)胞攝取，而且即便裸基因能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，也會被胞內(nèi)的核酸酶所降解。因此，尋找理想的基因載體是基因療法所面臨的一大難題。目前應(yīng)用的基因載體可分為兩大類病毒載體和非病毒載體。病毒載體，主要包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等，它們轉(zhuǎn)染效率較高，但由于受到免疫原性、承載DNA能力、細(xì)胞靶向性和成本等因素的影響，限制了其應(yīng)用，參見Luo，D.等人，Synthetic DNAdelivery systems, Nat. Biotechnol. 2000，18，33-37。非病毒載體，主要是陽離子載體通過其帶正電荷的基團(tuán)與DNA帶負(fù)電荷的磷酸根發(fā)生靜電作用，從而減弱DNA鏈上磷酸根負(fù)電荷之間的排斥作用，導(dǎo)致DNA彎曲、凝聚，甚至將DNA包載成一定大小的復(fù)合物進(jìn)行傳輸，有關(guān)一些合成類物質(zhì)用于基因轉(zhuǎn)染的研究已引起人們的廣泛關(guān)注。其中，非病毒載體研究較多的幾類為脂類(參見Feigner, P. L.等，Lipofection:Ahighly efficient, Iipid—mediated DNA-transfectionprocedure, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1987，84，7413-7417)、聚電解質(zhì)(polyethylenimine 聚乙烯亞胺，參見Boussif, 0.等人，A versatile vector for gene and oligo-nucleotide transferinto celIsin culture and in vivo:Polyethyenimine,Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 1995, 92:7297-7301; dendrimers 樹枝狀聚合物，參見 Nylander, Τ·等人，DNAcondensation using cationicdendrimers-morphology and supramolecular structureof formed aggregates, Soft Matter 2011,7,4577-4594)、高價陽離子物質(zhì)(參見Leroux,J. C. Gene delivery with bisphosphonate-stabilized calcium phosphatenanoparticles, J. Control. Release 2011, 150, 87-93)等。盡管有關(guān)非病毒基因載體與DNA相互作用的研究受到了重視，但目前常用的陽離子型聚合物作為基因載體的一個很大局限性在于聚合物分子的大小和價態(tài)的非均一性，這種非均一性直接導(dǎo)致所制備的載體/DNA結(jié)構(gòu)不同，給生物體內(nèi)的釋放研究帶來巨大困難。因此，隨著基因療法的不斷發(fā)展，需要發(fā)展新型的非病毒基因載體，提聞載體/DNA結(jié)構(gòu)的均一性，提聞基因轉(zhuǎn)染的效率，最終提聞基因治療的效果。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種陽離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s-Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提出一種[Cn-s_Cnim]Br2作為非病毒基因載體負(fù)載DNA的技術(shù)方案，即[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物、制備方法及其在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。為了有助于理解本發(fā)明，下面定義了一些術(shù)語。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。除非另外說明，本文中的[Cn-s-Cnim]Br2(n=10, 12，14 ；s=2, 4, 6)是指陽離子型咪唑Gemini表面活性劑，是由雙頭部和雙尾部構(gòu)成，中間由橋連基團(tuán)(短鏈飽和脂肪鏈)連接， 所述頭部由咪唑雜環(huán)構(gòu)成，所述尾部由疏水飽和脂肪鏈構(gòu)成。除非另外說明，本文中的DNA是指質(zhì)粒DNA。除非另外說明，本文中的復(fù)合物是指由兩種或兩種以上的不同的物質(zhì)所形成的結(jié)合體。納米復(fù)合物是指結(jié)合體的大小尺寸在納米級別。例如[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物是指由DNA通過相互結(jié)合而形成的結(jié)合體，復(fù)合物的尺寸大小在納米級別。除非另外說明，本文中的Z+/-是指表面活性劑中咪唑基團(tuán)所帶正電荷與DNA分子中磷酸基團(tuán)所帶負(fù)電荷的摩爾比。盡管經(jīng)由理論計(jì)算得出每個咪唑基團(tuán)所帶正電荷為O. 74(參見Xu, G. Y.等人，Comparison of Aggregation Behaviors between Ionic Liquid-TypeImidazolium GeminiSurfactant[C12-4-C12im]Br2 and Its Monomer[C12mim]Br onSilicon Wafer, Langmuir, 2009, 25, 9721-9727),為簡化計(jì)算，本文中每個Gemini 表面活性劑所帶正電荷以整數(shù)2進(jìn)行計(jì)算。為了實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案—種陽離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s_Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用,所述陽離子型咪唑Gemini表面活性劑，通式為[Cn-S_Cnim]Br2，n=10, 12，14 ；s=2,4,6,作為非病毒基因載體在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用時，先將[Cn-s-Cnim]Br2溶解于pH6. 8-7. 5的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液中，取100 μ L加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，孵育24小時，利用酶標(biāo)儀測試細(xì)胞樣品的吸光度值來測試細(xì)胞的存活率，通過細(xì)胞存活率判定[(^-『(^!!!扣^細(xì)胞毒性；所述的細(xì)胞包括人胚腎細(xì)胞(ΗΕΚ293細(xì)胞)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(Α549Υ-10細(xì)胞)或人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)。細(xì)胞存活率(％)=A570 (樣品)/A57tl (對照)X 100% (I)其中A57tl (樣品)為加入[Cn-s-Cnim]Br2后的細(xì)胞的吸光度，A570 (對照)為空白對照的細(xì)胞的吸光度。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地，非病毒基因載體選自[C1Q-4-C1Qim]Br2、[C12-4_C12im]Br2、[C14-4-C14im]Br2、[C12-2_C12im]Br2 和[C12-6_C12im]Br2。進(jìn)一步優(yōu)選地，非病毒基因載體選自[C12-2-C12im]Br2、[C12-4-C12im]Br2 和[C12-6_C12im]Br2。其中，非病毒基因載體以[C12-4_C12im]Br2為例說明，其有效誘導(dǎo)DNA凝聚，高效轉(zhuǎn)染基因。[C12-4-C12im]Br2可根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)制備,例如可參見Xu, G. Y.等人，SynthesisandProperties of Ionic Liquid-Type Gemini Imidazolim Surfactants, J. ColloidInterface Sci. 2008，326490-495;Aggregation and Thermodynamic Propertiesof Ionic Liquid-Type Gemini ImidazoliumSurfactants with Different SpacerLength, Colloid Polym Sci. 2009，287，395-402 文獻(xiàn)提供的方法制備。[C12-4_C12im]Br2 結(jié)
構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.一種陽離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s-Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用,所述陽離子型咪唑Gemini表面活性劑，通式為[Cn-S_Cnim]Br2，n=10，12，14 ；s=2,4,6,作為非病毒基因載體直接應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染時，先將[Cn-s-Cnim]Br2溶解于pH 6. 8-7. 5的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液中，取100 μ L加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，孵育24小時，利用酶標(biāo)儀測試細(xì)胞樣品的吸光度值來測試細(xì)胞的存活率，通過細(xì)胞存活率判定[Cn-s-Cnim]Br2細(xì)胞毒性；所述的細(xì)胞包括人胚腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549Y-10細(xì)胞)或人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述陽離子型咪唑Gemini表面活性劑選自[C12-2-C 12im]Br2、[C12-4_C12im]Br2 和[C12-6-C12im]Br2 ;其中，優(yōu)選[C12-4_C12im]Br2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于陽離子型咪唑Gemini表面活性劑[C12-4-C12im]Br2有效誘導(dǎo)DNA凝聚形成[C12-4_C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物,包括步驟如下 分別用緩沖液配制[C12-4-C12im]Br2溶液和DNA溶液，[C12-4-C12im]Br2與DNA按照冗+/_為(1 50) : (I(Tl)的摩爾比制備混合溶液，使DNA溶液的終濃度為I X 10_6mOl/L I X 10_4mOl/L，再將該混合溶液室溫下孵育15 40分鐘，得到[C12-4_C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述[C12-4-C12im]Br2與DNA按照Z+/_為(Γ2): (I(Tl)的摩爾比；優(yōu)選地，所述[(12-4-(12址]81'2與0嫩按照Z+/-為(I 2): (2 I)的摩爾比。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于制備DNA溶液和[C12-4-C12im]Br2溶液的混合溶液時，將兩種溶液混勻并漩渦震蕩15 40秒；優(yōu)選地，漩渦震蕩30秒；混合溶液中DNA溶液的終濃度保持在I X 10_5mOl/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于用[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的方法為取制備的[(12-4-(121111]81'2/1)嫩納米復(fù)合物200^加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，所述的細(xì)胞選自人胚腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞或人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞；經(jīng)過24小時的孵育，用熒光倒置顯微鏡測定質(zhì)粒DNA上的綠色熒光蛋白(GFP)基因的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種陽離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s-Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。本發(fā)明中非病毒基因載體為陽離子型咪唑Gemini表面活性劑([C12-4-C12im]Br2)，緩沖液配制的[C12-4-C12im]Br2溶液可直接應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染。本發(fā)明還提供了[C12-4-C12im]Br2有效誘導(dǎo)DNA凝聚形成[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物的方法；向受體細(xì)胞添加[C12-4-C12im]Br2/DNA的納米復(fù)合物的緩沖液溶液，可以實(shí)現(xiàn)基因在細(xì)胞內(nèi)的高效率轉(zhuǎn)染。本發(fā)明中[Cn-s-Cnim]Br2及[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物對不同的細(xì)胞均具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，且對于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低。
文檔編號C12N15/63GK102943086SQ201210404508
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者徐桂英, 周亭, 楊延蓮, 敖明祺, 李平, 王琛 申請人:山東大學(xué)