專利名稱：一種用于檢測(cè)甲肝病毒的分子馬達(dá)生物傳感器試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于食源性病毒快速檢測(cè)技術(shù)的一種。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)甲肝病毒(HAV)的檢測(cè)方法是通過細(xì)胞培養(yǎng)，但甲肝病毒不僅增殖時(shí)間長(zhǎng)、增殖能力低，且不形成細(xì)胞病變，難以滿足檢測(cè)的要求。20世紀(jì)80年代建立的RT-PCR和ICC/PCR(integrated cell culture,PCR)等檢測(cè)技術(shù)提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性,在甲肝病原監(jiān)測(cè)中有很好的應(yīng)用，但其檢測(cè)時(shí)間仍需5-6h，且容易受PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性的可能，這類技術(shù)仍然需要依據(jù)放射性物質(zhì)標(biāo)記的RNA探針或通過凝膠電泳中的特定RNA條帶來判斷檢測(cè)結(jié)果，且整個(gè)過程需要擴(kuò)增、電泳等步驟，操作繁瑣。不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，給使用亦帶來很大不便。因 此急需可靠有效的快速檢測(cè)方法，縮短窗口期，避免因食源性甲肝病毒感染而引起的甲型肝炎的發(fā)生和流行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明核心技術(shù)是利用載色體Chromatophore上的FOFl-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器，集成核酸探針識(shí)別、熒光探針標(biāo)記與檢測(cè)等技術(shù)，建立了一個(gè)全新概念的快速檢測(cè)技術(shù)體系。利用ATP酶作為載體對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)。在FtlF1-ATPase分子馬達(dá)連接上特異的核酸探針，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測(cè)。本發(fā)明可將檢測(cè)時(shí)間縮短至lh，且檢測(cè)靈敏度能達(dá)到0.01ng/mL，滿足現(xiàn)有的食源性病毒檢測(cè)范圍。


附圖1為分子馬達(dá)生物傳感器模式圖(其中a、b、c、α、β、δ、Υ、ε均為ATP合酶亞基)，I為ε亞基抗體,2為鏈霉親和素(Strptavidin), 3為N_biotin, 4為甲肝病毒特異性探針，5為甲肝RNA鏈。附圖2為chix) HAV對(duì)不同種病毒的檢測(cè)結(jié)果，縱坐標(biāo)表示熒光值，橫坐標(biāo)表示檢測(cè)的病毒種類。附圖3為chro HAV對(duì)13個(gè)添加甲肝病毒食品樣品和2個(gè)不含有甲肝病毒食品樣品的檢測(cè)結(jié)果，縱坐標(biāo)表示熒光值，橫坐標(biāo)表示檢測(cè)的樣本，I 15為食品檢測(cè)樣本編號(hào)。
具體實(shí)施例方式根據(jù)甲肝病毒各型設(shè)計(jì)具有各型共有的特異性的核酸探針5’-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-3’，其中探針的5’用生物素進(jìn)行標(biāo)記。將該探針通過生物素抗體連接在分子馬達(dá)上面，利用突光探針DHPE標(biāo)記的載色體Chromatophore上的FtlF1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器即可對(duì)待測(cè)樣本的RNA進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)樣品為甲肝病毒RNA時(shí)，檢測(cè)時(shí)與生物傳感器結(jié)合的同時(shí)啟動(dòng)ATP合成，體系的熒光值會(huì)發(fā)生明顯的變化，通過這一變化即可判斷樣本為陽(yáng)性。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)試劑盒，可以方便、快速對(duì)甲肝病毒進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒組成:
權(quán)利要求
1.本發(fā)明要求保護(hù)的內(nèi)容有:異性核酸探針與FtlF1-ATP合酶連接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亞基上依次連接ε亞基抗體、生物素、鏈霉親和素、生物素標(biāo)記的甲肝病毒特異性探針。
2.劑盒檢測(cè)體系的反應(yīng)條件:室溫溫育lOmin。
3.成buffer、啟動(dòng)buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20 氯化鎂5mM,Tricine50mM,憐酸氫二鉀 5mM ;啟動(dòng) buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer = 1: 3 (v/v)；PBS:137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀， IOmM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀。
全文摘要
一種用于檢測(cè)甲肝病毒的分子馬達(dá)生物傳感器試劑盒，屬于食源性病毒快速檢測(cè)領(lǐng)域，主要解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法培養(yǎng)增殖周期長(zhǎng)、增殖能力低，不形成細(xì)胞病變，難以滿足檢測(cè)要求。本發(fā)明的核心技術(shù)是利用載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器，F(xiàn)0F1-ATP合酶由于能快速地旋轉(zhuǎn)，通過旋轉(zhuǎn)它建立了催化位點(diǎn)與質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)之間的偶聯(lián)。首先在ATP合酶的ε亞基上連接甲肝病毒各型的共有序列特異性探針，將待測(cè)樣品和陰性對(duì)照分別與生物傳感器結(jié)合后，比較其催化ATP合成10分鐘后的ATP產(chǎn)生量，ATP合成的多寡可以通過環(huán)境中H+的量進(jìn)行測(cè)量，而H+的多寡通過H-DHPE所體現(xiàn)的熒光強(qiáng)度大小來獲得。本方法具有反應(yīng)時(shí)間短，抗原抗體結(jié)合充分，操作使用方便等特點(diǎn)，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度。本試劑盒可對(duì)待測(cè)食品樣本中的甲肝病毒進(jìn)行快速、靈敏、高通量的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12R1/93GK103088153SQ201210406050
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者張捷, 許美玲, 張雷, 張惠媛, 劉巖, 盧曉宇, 顧德周, 汪琦, 張昕, 王佩榮, 陳廣全, 樂加昌 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局, 臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局