專利名稱：一種用于檢測輪狀病毒的分子馬達生物傳感器試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于食源性病毒快速檢測技術(shù)的一種。
背景技術(shù)：
輪狀病毒是嬰幼兒腹瀉主要病原體。輪狀病毒的經(jīng)典病原檢測方法包括電鏡技術(shù)和分離培養(yǎng)。電鏡技術(shù)要求每毫升樣本中包含約IO6個病毒顆粒，而且病毒顆粒易于降解，對正確診斷產(chǎn)生影響。分離培養(yǎng)檢測技術(shù)的檢測靈敏度較低，需要特殊培養(yǎng)條件，對輪狀病毒的基礎(chǔ)研究和臨床診斷價值有限。以抗原檢測為基礎(chǔ)的檢測方法特異性和靈敏度較低，而且不能有效地進行定量檢測。PCR技術(shù)具有更高的靈敏度，不需細(xì)胞培養(yǎng)，但是檢測費用高，且操作步驟繁瑣，需要時間長。目前開發(fā)的輪狀病毒檢測方法中，提高檢測方法的靈敏度、特異性，開發(fā)經(jīng)濟實用的試劑盒仍是輪狀病毒檢測技術(shù)的主要方向。發(fā)展快速、高效輪狀病毒檢測新的檢測方法對有效預(yù)防輪狀病毒疫情的暴發(fā)，鑒定輪狀病毒的污染狀況，評估環(huán)境衛(wèi)生狀況等將發(fā)揮重要作用。
發(fā)明內(nèi)容
以受控分子馬達技術(shù)為核心，集成核酸探針識別、熒光探針標(biāo)記與檢測等技術(shù)，建立了一個全新概念的快速檢測技術(shù)體系。利用ATP酶作為載體對目標(biāo)物進行檢測具有靈敏度高、特異性強、快速的特點。分子馬達連接上特異的核酸探針，可以實現(xiàn)對特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測。本發(fā)明可將檢測時間縮短至I 1.5h，且檢測靈敏度能達到0.005ng/mL，滿足現(xiàn)有的食源性病毒檢測范圍。
附圖1為分子馬達生 物傳感器模式圖(其中a、b、c、α、β、δ、Υ、ε均為ATP合酶亞基)，I為ε亞基抗體，2為鏈霉親和素(Strptavidin)，3為N-biotin，4為VP7探針，5為輪狀病毒單鏈RNA。附圖2為chix) VP7對不同種菌株的檢測結(jié)果，縱坐標(biāo)表示熒光值，橫坐標(biāo)表示檢測的樣本，其中I為水，2輪狀病毒,3為甲肝病毒,4為諾如病毒。附圖3為chro VP7對15個添加輪狀病毒食品樣本的檢測結(jié)果,縱坐標(biāo)表不突光值,橫坐標(biāo)表示檢測的樣本,I 15為食品檢測樣本編號。
具體實施例方式根據(jù)輪狀病毒VP7基因設(shè)計特異性核酸探針5’-AGCACAACATTATAATCACAGTATAGTTTGGGTCGA-3’，其中探針的5’用生物素進行標(biāo)記。將該探針通過生物素抗體連接在分子馬達上面，利用分子馬達生物傳感器即可對待測樣本的RNA進行檢測，當(dāng)樣品為輪狀病毒RNA時，檢測體系的熒光值會發(fā)生明顯的變化，通過這一變化即可判斷樣本為陽性。為此，我們設(shè)計了一個試劑盒，可以方便、快速對食源性輪狀病毒進行檢測。
試劑盒組成:
權(quán)利要求
1.本發(fā)明要求保護的內(nèi)容有:異性核酸探針與FtlF1-ATP合酶連接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亞基上依次連接ε亞基抗體、生物素、鏈霉親和素、生物素標(biāo)記的輪狀病毒核酸探針。
2.劑盒檢測體系的反應(yīng)條件:室溫溫育10min。
3.成buffer、啟動buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20 氯化鎂5mM,Tricine50mM,憐酸氫二鉀 5mM ;啟動 buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer = 1: 3 (v/v)；PBS:137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀。
全文摘要
一種用于檢測食源性輪狀病毒的分子馬達生物傳感器試劑盒，屬于食源性病毒快速檢測領(lǐng)域，主要解決傳統(tǒng)檢測周期過長、所需儀器設(shè)備昂貴的問題。本發(fā)明的核心技術(shù)是利用載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器，F(xiàn)0F1-ATP合酶由于能快速地旋轉(zhuǎn)，通過旋轉(zhuǎn)它建立了催化位點與質(zhì)子轉(zhuǎn)運之間的偶聯(lián)。首先在ATP合酶的ε亞基上連接VP7探針，將待測樣品和陰性對照分別與生物傳感器結(jié)合后，比較其催化ATP合成10分鐘后的ATP產(chǎn)生量，ATP合成的多寡可以通過環(huán)境中H+的量進行測量，而H+的多寡通過H-DHPE所體現(xiàn)的熒光強度大小來獲得。本試劑盒可對待測樣本中的食源性輪狀病毒進行快速、靈敏、高通量的檢測，能有效縮短檢測周期，提高工作效率。
文檔編號C12Q1/70GK103088155SQ20121040607
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者張捷, 楊麗君, 張惠媛, 盧曉宇, 許美玲, 顧德周, 劉巖, 汪琦, 張昕, 王佩榮, 陳廣全, 樂加昌 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局, 煙臺出入境檢驗檢疫局