專(zhuān)利名稱(chēng)：一種寡聚核苷酸的修飾方法，由該方法得到的修飾寡聚核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種寡聚核苷酸的修飾方法，還涉及由該方法制備得到的修飾寡聚核苷酸及其應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基于核酸的一些藥物如反義寡核苷酸、肽核酸以及很有希望的小干擾RNA(SiRNA)要想發(fā)展成為有用的治療藥物，提高其跨膜能力以及耐穩(wěn)定性是必須解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。很多技術(shù)已經(jīng)被用來(lái)提高這類(lèi)化合物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，例如，通過(guò)寡核苷酸序列上的堿基修飾，糖環(huán)修飾以及骨架替換等策略提高其血清穩(wěn)定性；通過(guò)脂質(zhì)體和納米聚合物包裹等方法提高寡核苷酸的跨膜，這些方法有其優(yōu)勢(shì)也有不足。如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)引起不同程度的副作用，骨架修飾導(dǎo)致與靶mRNA結(jié)合能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致活性下降。而通過(guò)將透膜性肽、膽固醇等疏水性分 子綴合于寡核苷酸的末端來(lái)提高其跨膜能力已有很多研究。此外寡核苷酸硫代修飾能夠提高耐酶穩(wěn)定性也有很多報(bào)道。但是將兩種策略進(jìn)行組合，利用兩種修飾策略的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行組合修飾目前還沒(méi)有報(bào)道。因此，這里我們提供的策略組合，能夠有效利用兩種策略的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)避免單種策略的不足，提高寡聚核苷酸的成藥性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種寡聚核苷酸的修飾方法，即組合末端修飾和中間磷酸部分修飾兩種策略，如將透膜性的多肽或者疏水性分子綴合于寡聚核苷酸末端的同時(shí)，對(duì)序列進(jìn)行硫代或硒代修飾。通過(guò)這種策略修飾能夠提高寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而提高其成藥性。本發(fā)明的一種寡聚核苷酸的修飾方法，其特征在于包括以下步驟:( I)合成綴合物分子:所述的綴合物分子為功能性分子，包括多肽，醇類(lèi)、靶向性分子以及人體必需的分子;(2)連接臂的形成綴合物分子與寡聚核苷酸共價(jià)綴合的連接臂是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵得到；(3)寡聚核苷酸的合成及修飾在合成的連有連接臂的綴合物分子的基礎(chǔ)上進(jìn)一步合成寡聚核苷酸，并對(duì)寡聚核苷酸上磷酸部分非橋聯(lián)的氧原子用硫原子或硒原子進(jìn)行取代，完成目標(biāo)寡聚核苷酸的修飾。 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(I)中所述的多肽包括透膜性肽序列，所述的醇類(lèi)包括疏水性的油醇、膽固醇，所述的靶向性分子包括甘露糖、半乳糖，所述的人體必需的分子包括維生素E以及抗體。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的共價(jià)鍵包括磷酸二酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、硫醚鍵以及通過(guò)Click反應(yīng)以及Diels-Alder反應(yīng)構(gòu)建的共價(jià)鍵。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(3)中所述的寡聚核苷酸包括反義寡核苷酸、RNA、適配體、二聚物以及三聚物。在本發(fā)明中，步驟(3)中硫代修飾或硒代修飾的數(shù)量為寡聚核苷酸中的一個(gè)至序列中全部的磷酸被修飾。在本發(fā)明中，步驟(3)中綴合修飾的末端位于寡聚核苷酸的3’端、5’端或者同時(shí)位于3’端和5’端。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了由以上任一項(xiàng)所述的方法合成的修飾寡聚核苷酸。采用的本發(fā)明的方法制備得到的修飾寡聚核苷酸其由四部分組成，如圖1所示，I為綴合物分子；11為連接臂；111為寡聚核苷酸；IV為修飾位點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的修飾寡聚核苷酸中綴合物分子為一信號(hào)肽序列，寡聚核苷酸為編碼轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3型受體mRNA的反義寡核苷酸，且從5’端起第6_16為核苷酸之間的磷酸骨架中非橋聯(lián)的氧原子被硫原子取代，所述的信號(hào)肽序列與所述的反義寡核苷酸的3’端通過(guò)共價(jià)鍵綴合。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的修飾寡聚核苷酸在制備拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3型受體藥物中的應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明的修飾后的寡核苷酸結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例的反應(yīng)流程圖；圖3為修飾反義核酸MlOS顯示劑量依賴(lài)性的活性；圖4為天然未修飾反義核酸不具有劑量依賴(lài)性。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的一種寡聚核苷酸的修飾方法，包括以下步驟:( 1)綴合物分子的合成方法根據(jù)本發(fā)明，綴合的分子多為一些功能性的分子，如透膜性肽序列，疏水性的油醇、膽固醇，靶向性分子如甘露糖、半乳糖，人體必需的分子如維生素E以及抗體等。這些功能性分子大多可以商業(yè)獲得。對(duì)于需要合成的分子如透膜性肽等可用成熟的Fmoc，Boc化學(xué)制備。(2)連接臂的形成根據(jù)本發(fā)明，將綴合物分子與寡核苷酸鏈接的連接臂主要通過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵得到。這樣的共價(jià)鍵均屬于常規(guī)的化學(xué)反應(yīng)，包括但不限于磷酸二酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、硫醚鍵、通過(guò)“Click”反應(yīng)以及Diels-Alder反應(yīng)(Kui Lu, Qun-Peng Duan等，Bioconjugate Chem.2010, 21, 187 - 202 ；Natarajan Venkatesan and Byeang Hyean Kim,Chem.Rev.2006，106，3712-3761)形成的共價(jià)鍵等。(3)寡核苷酸磷酸骨架部分的修飾
磷酸骨架修飾主要包括但不限于硫代，硒代修飾等。以硫代修飾為例，可以采取全部硫代或者部分硫代，通過(guò)購(gòu)買(mǎi)商用的硫代試劑如EDITH，DTD, PADS, DDTT以及Beaucage試劑(結(jié)構(gòu)式如下所示)，在寡核苷酸合成過(guò)程中通過(guò)對(duì)合成儀設(shè)置而實(shí)現(xiàn)任何單位點(diǎn)、部分或者全部硫代。
O
S-SS-S
o、0丨 DDTTEDITH
Beaocage reagent (sutfurizing reagent 11)
xn^s^syn'-
PADS °OTD 0為了更好地理解本發(fā)明，通過(guò)實(shí)例進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例1以氨化的CPG樹(shù)脂為載體，首先通過(guò)Spacer增加樹(shù)脂的溶脹性及降低反應(yīng)空間位阻。然后米用Boc方法合成/[目號(hào)妝序列，合成的彳目號(hào)條序列為L(zhǎng)ys-Ala-Leu-Leu-Ala-Leu,脫除末端氨基Boc保護(hù)基，與2，2- 二甲基-3-甲氧基三苯甲氧基丙酸縮合，最后用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰化法在ABI 394合成儀上合成目標(biāo)寡核苷酸，該目標(biāo)寡核苷酸為靶向miR-328的反義寡核苷酸，其具體序列為5’ -ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3’，miR-328能夠使靶轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3型受體(TGFiiRIII)的表達(dá)下 降，通過(guò)反義寡聚核苷酸沉默miR-328從而使受體蛋白表達(dá)增加。合成規(guī)模為I μ mol，堿基偶聯(lián)時(shí)間為30秒，重復(fù)偶聯(lián)3次。硫代序列合成時(shí)，用硫代試劑苯乙酰二硫化物(PADS，0.2M)代替12液，并延長(zhǎng)氧化時(shí)間由15秒延長(zhǎng)至600秒，反應(yīng)流程圖2所示。利用上述實(shí)例我們制備了反義核酸3’端肽綴合修飾且從5’端起第6-16位核苷酸之間的磷酸骨架硫代修飾的寡核苷酸修飾物(MlOS)，蛋白水平實(shí)驗(yàn)表明，這種修飾物有明顯的劑量依賴(lài)性，而未修飾的天然序列則沒(méi)有顯示劑量依賴(lài)性的特點(diǎn)，如圖3、圖4所示。本文顯示并詳細(xì)描述的信息足以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，因此本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案代表本發(fā)明的主題，該主題為本發(fā)明所廣泛涵蓋。本發(fā)明的范圍完全涵蓋其它對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的實(shí)施方案，因此，本發(fā)明的范圍不被除所附權(quán)利要求之外的任何內(nèi)容所限制，其中除了明確說(shuō)明外，所用元素的單數(shù)形式并不是指“一個(gè)和唯一”，而是指“一個(gè)或更多”。對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，所有公知的上述優(yōu)選的實(shí)施方案和附加實(shí)施方案部分的結(jié)構(gòu)、組成和功能上的等價(jià)物因此引入本文作參考，而且試圖被本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。此外，不需要某種設(shè)備或方法來(lái)表達(dá)本發(fā)明所解決的每個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兌家寻ㄔ诒景l(fā)明的權(quán)利要求之內(nèi)。另外，無(wú)論本發(fā)明公開(kāi)事實(shí)中的所有部分、成分，或者方法步驟是否在權(quán)利要求中被明確敘述，它們都沒(méi)有貢獻(xiàn)給公眾。但是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很明顯在不背離如所附權(quán)利要求中所闡明的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，可以在形式、試劑和合成細(xì)節(jié)上做出各種改變和修飾。
權(quán)利要求
1.一種寡聚核苷酸的修飾方法，其特征在于包括以下步驟: (1)合成綴合物分子 所述的綴合物分子為功能性分子，包括多肽，醇類(lèi)、靶向性分子以及人體必需的分子； (2)連接臂的形成 綴合物分子與寡聚核苷酸共價(jià)綴合的連接臂是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵得到； (3)寡聚核苷酸的合成及修飾 在合成的連有連接臂的綴合物分子的基礎(chǔ)上進(jìn)一步合成寡聚核苷酸，并對(duì)寡聚核苷酸上磷酸部分非橋聯(lián)的氧原子用硫原子或硒原子進(jìn)行取代，完成目標(biāo)寡聚核苷酸的修飾。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述的多肽包括透膜性肽序列，所述的醇類(lèi)包括疏水性的油醇、膽固醇，所述的靶向性分子包括甘露糖、半乳糖，所述的人體必需的分子包括維生素E以及抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的共價(jià)鍵包括磷酸二酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、硫醚鍵以及通過(guò)Click反應(yīng)以及Diels-Alder反應(yīng)構(gòu)建的共價(jià)鍵。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的寡聚核苷酸包括反義寡核苷酸、RNA、適配體、二聚物以及三聚物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中硫代修飾或硒代修飾的數(shù)量為寡聚核苷酸中的一個(gè)至序 列中全部的磷酸被修飾。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中綴合修飾的末端位于寡聚核苷酸的3’端、5’端或者同時(shí)位于3’端和5’端。
7.由權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法合成的修飾寡聚核苷酸。
8.如權(quán)利要求7所述的修飾寡聚核苷酸，其特征在于所述的修飾寡聚核苷酸中綴合物分子為一信號(hào)肽序列，寡聚核苷酸為編碼轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3型受體mRNA的反義寡核苷酸，且從5’端起第6-16位的核苷酸之間的磷酸骨架中非橋聯(lián)的氧原子被硫原子取代，所述的信號(hào)肽序列與所述的反義寡核苷酸的3’端通過(guò)共價(jià)鍵綴合。
9.權(quán)利要求8所述的修飾寡聚核苷酸在制備拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3型受體藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種寡聚核苷酸的修飾方法，由該方法得到的修飾寡聚核苷酸及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)這種修飾改善目的寡聚核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和成藥性。本發(fā)明的一種寡聚核苷酸修飾方法，結(jié)合了寡核苷酸末端修飾和骨架修飾兩種策略，能夠有效解決寡聚核苷酸藥物的一些不足，具有潛在的藥物開(kāi)發(fā)前景。本發(fā)明的一種寡聚核苷酸的修飾方法，方法簡(jiǎn)單，容易操作，便于規(guī)模化制備。
文檔編號(hào)C12N15/113GK103243086SQ20121040783
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者楊振軍, 王曉鋒, 初文峰, 楊寶峰 申請(qǐng)人:北京大學(xué)