專利名稱：一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法。
背景技術(shù)：
赤星病(Alternaria alternata)是一種重要的煙草葉斑病,煙草赤星病的病原為鏈格抱菌(Alternaria alternata (Fries) Keissler),屬半知菌亞門(Deuteromyccotina),絲抱綱(Hyphomycetes),絲抱目(Hyphomycetoles),鏈格抱屬(Alternaria)。菌絲無色透明，有分隔。分生孢子單生或成串生長于分生孢子梗上，分生孢子梗聚集成堆，頂端彎曲，不規(guī)則，孢子呈倒棒錘形，有縱、橫分隔，縱格1-3個，橫格3-7個；在孢子鏈末端的分生孢子較小，橢圓形，只有一個分隔。分生孢子的大小形狀，因其菌齡和產(chǎn)生孢子時間長短不同差異很大。煙草赤星病菌只能侵染煙屬植物，其中普通煙亞屬和黃花煙亞屬比碧冬煙亞屬更感·龍葵、曼陀羅、木氏寥，酸漿屬的大千生，以及煙田的一些雜草等可被侵染。1892年美國首次報道發(fā)現(xiàn)該病，隨后一直屬于美國煙草上的次要病害，但是1956年該病在美國北卡羅來納州突然爆發(fā)流行，隨后一段時間內(nèi)成為美國各煙區(qū)的毀滅性病害。至今，赤星病在世界各國均有發(fā)生，20世紀60年代和80年代曾在我國煙草上大發(fā)生，給我國的煙葉生產(chǎn)帶來了巨大的損失，近幾年在我國部分煙葉產(chǎn)區(qū)再度流行。如，煙草赤星病在山東俗稱“紅斑”，河南、安徽、遼寧俗稱“斑病”，云南稱“恨虎眼”，貴州稱“火炮斑”。是一種廣泛發(fā)生于世界各煙區(qū)的嚴重病害。赤星病不僅使煙葉殘缺不全，在烘烤過程中病斑仍繼續(xù)擴大，使烘烤葉片顏色不勻、葉片厚薄不均，等級下降，而且由于內(nèi)在品質(zhì)不協(xié)調(diào)，如總氮、蛋白質(zhì)升高，總糖、還原糖降低，糖堿比值下降，使吃味變差，降低了工業(yè)使用價值。因此，選擇與培育抗赤星病的煙草品種是防治該病的當務之急，也是防治該病最經(jīng)濟與有效的途徑。為了培育煙草抗赤星病的品種，需要不斷地挖掘抗源，鑒定出抗煙草赤星病的種子材料。目前，煙草品種抗赤星病的常規(guī)鑒定方法主要有2種，一種是離體葉片法，另一種是幼苗浸根法。上述方法都是利用煙株，并且需要待植株長到一定大小才能開展。如，離體葉片法鑒定一個抗病品種需要時間很長，要等到煙株成熟時開展。再如，幼苗浸根法是利用煙草赤星病菌產(chǎn)生的毒素，浸泡煙株的根，很難排除毒素液中雜菌對植株幼根生長的影響。因此這些鑒定方法都存在著較大缺陷。為了快速培育抗赤星病的煙草品種，迫切需要一種快速、經(jīng)濟、方便、可靠的方法來解決這一技術(shù)難題。寄主?；远舅?Host Specific Toxins, HST),是特定植物病原真菌產(chǎn)生的一類對其寄主植物種類或者栽培品種具有特異性生理活性和高度?；宰饔玫拇x產(chǎn)物，寄主?；远舅厥侵苯記Q定植物病原真菌致病性的重要因素。煙草赤星病菌能夠產(chǎn)生寄主?；远舅亍?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，發(fā)明一種利用煙草赤星病菌產(chǎn)生的毒素制作含毒素培養(yǎng)基，并在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草的種子，從而直接從煙草種子中篩選出煙草抗赤星病種質(zhì)材料的快速、經(jīng)濟、方便、可靠的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了一種在培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法，其中，按照下部步驟操作a、在一種瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草赤星病菌；b、將直徑為5mm的煙草赤星病菌菌餅接種于250ml查彼培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)28-30d ；C、紗布過濾除去菌絲體，再經(jīng)3-5次離心，SOOOr/分鐘，鏡檢無細胞，獲得毒素粗提液； d、用生物測定的方法確定毒素的活性；e、用水將毒素粗提液稀釋2-16 (V/V)倍，加入I. 8_2. 0% (W/V)瓊脂配成含毒素培
養(yǎng)基;f、121 °C濕熱滅菌含毒素培養(yǎng)基15_30min ；g、消毒煙草種子；h、用鑷子將消毒后的煙草種子夾取到含毒素的培養(yǎng)基上，封口膜封口，于25-280C、12h光照/d培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)14d以上；i、根據(jù)煙苗根是否長進培養(yǎng)基中，鑒定出抗煙草赤星病的煙草種質(zhì)材料。步驟b進一步包括配制查彼培養(yǎng)液
NaNO3 2g K2HPO4 Ig KCl 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 O. Olg 篇糖 30g 瓊脂 18-20g 水1000ml
pH自然步驟d用生物測定的方法確定毒素的活性，具體為取6-8葉期的感病品種NC89煙苗，在成熟伸展的葉片背面用注射器的針頭輕輕刺破葉片表皮，用去掉針頭的注射器吸取毒素濾液，然后輕輕將毒素從刺破部分注入煙草葉片，以兩葉脈間約1/3充滿毒素濾液且不溢出葉脈為宜，以培養(yǎng)液和清水同樣處理為對照。處理48h后觀察，以注射部位出現(xiàn)壞死斑為毒素具有活性的標志。步驟g、消毒煙草種子具體為煙草種子80-100粒倒入I. 5mL離心管，加75% (V/V)酒精中浸泡30s，吸出后無菌水換洗2次；加10% (V/V)雙氧水浸泡lOmin，無菌水換洗5次。步驟a進一步包括培養(yǎng)赤星病菌的步驟于一種瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)赤星病菌，待赤星病菌長滿培養(yǎng)基后，取直徑5_的煙草赤星病菌菌餅用于步驟b接種。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下有益效果I.直接利用種子鑒定，就可以在培養(yǎng)皿中完成煙草種質(zhì)對赤星病的抗性鑒定，比常規(guī)鑒定試驗省略了培養(yǎng)煙株的繁瑣，節(jié)省了人力、物力與時間。通常常規(guī)試驗需要大面積實驗室條件和大面積的試驗地。2.使煙草對赤星病的抗性鑒定不受生長季節(jié)的限制，任何季節(jié)都能開展鑒定工作。并且在短時間內(nèi)可以完成大量種質(zhì)資源的篩選。3.不受其他雜菌的干擾，亦不會產(chǎn)生類似懸滴接種法鑒定因孢子分布不均而出現(xiàn) 接種強度不一致的現(xiàn)象，從而造成鑒定誤差。4.采用此種方法與已知抗感品種在大田中對赤星病的抗性表現(xiàn)一致。


圖I為本發(fā)明篩選方法的流程示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，對發(fā)明進行說明，如圖I所示，為本發(fā)明篩選方法的流程示意圖。本發(fā)明的實施例均按此附圖流程操作。實施例一、篩選方法如下a、在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草赤星病菌；b、待赤星病菌長滿培養(yǎng)基后，取直徑5mm的煙草赤星病菌菌餅接種于250ml查彼培養(yǎng)液中，28 °C振蕩培養(yǎng)28_30d ;c、紗布過濾除去菌絲體，再經(jīng)3-5次離心，SOOOr/分鐘，鏡檢無細胞，獲得煙草赤星病菌毒素粗提液；d、用生物測定的方法確定毒素的活性；e、用水將毒素粗提液稀釋2-16(V/V)倍，力口入I. 8-2.0% (W/V)瓊脂配成含毒素的培養(yǎng)基；f、于121°C條件下濕熱滅菌含毒素培養(yǎng)基15-30min ;g、消毒煙草種子；h、用鑷子將消毒后的煙草種子夾取到含毒素的培養(yǎng)基上，封口膜封口，于25-28°C、12h光照/d培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)14d以上；i、根據(jù)煙苗根是否長進培養(yǎng)基中，鑒定出抗煙草赤星病的煙草種質(zhì)材料。步驟d用生物測定的方法確定毒素的活性，具體為取6-8葉期的感病品種NC89煙苗，在成熟伸展的葉片背面用注射器的針頭輕輕刺破葉片表皮，用去掉針頭的注射器吸取毒素濾液，然后輕輕將毒素從刺破部分注入煙草葉片，以兩葉脈間約1/3充滿毒素濾液且不溢出葉脈為宜，以培養(yǎng)液和清水同樣處理為對照。處理48h后觀察，以注射部位出現(xiàn)壞死斑為毒素具有活性的標志。步驟g、消毒煙草種子具體為煙草種子80-100粒倒入I. 5mL離心管，加75% (V/V)酒精中浸泡30s，吸出后無菌水換洗2次；加10% (V/V)雙氧水浸泡lOmin，無菌水換洗5次。步驟a進一步包括培養(yǎng)赤星病菌的步驟于一種瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)赤星病菌，待病菌長滿培養(yǎng)基后，取直徑5_的煙草赤星病菌菌餅用于步驟b接種。鑒定結(jié)果如下表表I在不同濃度毒素培養(yǎng)基中煙草種子根系長進培養(yǎng)基中的株數(shù)比率)
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法，其特征在于，按照下列步驟操作 a、在一種瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草赤星病菌； b、將直徑為5mm的煙草赤星病菌菌餅接種于250ml查彼培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)28-30d ； C、紗布過濾除去菌絲體，再經(jīng)3-5次離心，SOOOr/分鐘，鏡檢無細胞，獲得毒素粗提液； d、用生物測定的方法確定毒素的活性； e、用水將毒素粗提液稀釋2-16(V/V)倍，加入1.8-2.0% (W/V)瓊脂配成含毒素培養(yǎng)基; f、121°C濕熱滅菌含毒素培養(yǎng)基15-30min； g、消毒煙草種子； h、用鑷子將消毒后的煙草種子夾取到含毒素的培養(yǎng)基上，封口膜封口，于25-28°C、12h光照/d培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)14d以上； i、根據(jù)煙苗根是否長進培養(yǎng)基中，鑒定出抗煙草赤星病的煙草種質(zhì)材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法，其特征在于，步驟b進一步包括配制查彼培養(yǎng)液 NaNO3 2g K2HPO4 Ig KCl 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 O. Olg 廉糖 30g 瓊脂 18-20g 水lOOOmlpH自然。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法，其特征在于，步驟d用生物測定的方法確定毒素的活性，具體為取6-8葉期的感病品種NC89煙苗，在成熟伸展的葉片背面用注射器的針頭輕輕刺破葉片表皮，用去掉針頭的注射器吸取毒素濾液，然后輕輕將毒素從刺破部分注入煙草葉片，以兩葉脈間約1/3充滿毒素濾液且不溢出葉脈為宜，以培養(yǎng)液和清水同樣處理為對照；處理48h后觀察，以注射部位出現(xiàn)壞死斑為毒素具有活性的標志。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法，其特征在于，步驟g、消毒煙草種子具體為將80-100粒煙草種子倒入I. 5mL離心管中，加入75% (V/V)酒精浸泡30s，用無菌水換洗2次；加入10% (V/V)雙氧水浸泡lOmin，用無菌水換洗5次。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法，其特征在于，步驟a進一步包括培養(yǎng)赤星病菌的步驟于一種瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)赤星病菌，待赤星病菌長滿培養(yǎng) 基后，取直徑5mm的煙草赤星病菌菌餅用于步驟b接種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)皿中篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料的方法，其中，按照下列步驟操作a.在一種瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草赤星病菌；b.于查彼培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)赤星病菌；c.粗提赤星病菌毒素；d.用生物測定的方法確定毒素的活性；e.加水稀釋毒素液并制作培養(yǎng)基；f.121℃濕熱滅菌含毒素培養(yǎng)基15-30min；g.消毒煙草種子；h.于毒素培養(yǎng)基上培育煙草種子；i.根據(jù)煙苗根是否長進培養(yǎng)基中，鑒定出抗煙草赤星病的煙草種質(zhì)材料。本發(fā)明利用煙草赤星病菌產(chǎn)生的毒素制作含毒素培養(yǎng)基，并在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草品種的種子，能夠快速、經(jīng)濟、方便、可靠的直接從煙草種子中篩選出煙草抗赤星病的種質(zhì)材料，本方法能夠替代田間試驗篩選，在培養(yǎng)皿中即可完成篩選煙草抗赤星病種質(zhì)材料。
文檔編號C12Q1/02GK102876767SQ20121040875
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者時焦, 孫麗萍, 孟坤, 張峻銓, 雒振寧, 王鳳龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所