專利名稱：非洲芥菜脂肪酸延長(zhǎng)酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及非洲芥菜 (Brassicatournefortii Gouan)脂肪酸延長(zhǎng)酶(FAEl)及其編碼基因。
背景技術(shù)：
芥酸(erucic acid，C22:1)是一種超長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸，主要存在于十字花科 (Brassicaceae)和金蓮花科(Tropaeolaceae)植物種子中。作為植物的代謝產(chǎn)物，芥酸還在一定程度上影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，在植物與環(huán)境的相互作用中，參與了生物膜角質(zhì)或蠟質(zhì)的合成。從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值來(lái)說(shuō)，芥酸是食用油的抗?fàn)I養(yǎng)成分，不易被人體消化吸收，容易導(dǎo)致冠心病和脂肪肝等病害發(fā)生。然而，在工業(yè)上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有較好的增塑性和疏水性，因此，具有廣泛的用途，是生產(chǎn)潤(rùn)滑劑、防腐劑、化纖原料和化妝品等化工產(chǎn)品的重要原料。
FAEl (Fatty Acid Elongase I)基因是調(diào)控芥酸合成的關(guān)鍵基因，雖然自James等最先從擬南芥中克隆到FAEl基因以來(lái)，陸續(xù)有完整的FAEl基因從各種十字花科植物中被分離出來(lái)，但目前對(duì)于FAEl基因的克隆僅局限于擬南芥及蕓苔屬少數(shù)幾種植物中，而十字花科是芥酸分布的主要種質(zhì)資源，植物種類多，芥酸含量復(fù)雜，是芥酸合成關(guān)鍵基因克隆的合適材料。
本發(fā)明通過(guò)BtFAEl基因的真核表達(dá)，獲得活性蛋白，同時(shí)脂肪酸含量檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白對(duì)芥酸合成有催化活性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)自于芥酸含量較高的非洲芥菜中的脂肪酸延長(zhǎng)酶 (Fatty Acid Elongase I, FAE1)及其編碼基因。
本發(fā)明的非洲芥菜的FAEl基因由1251個(gè)堿基組成，含有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框， 為序列表中的I號(hào)序列，將此基因命名為BtFAEl。
本發(fā)明的非洲芥菜FAEl蛋白由506個(gè)氨基酸組成，開(kāi)放閱讀框的起始密碼子為 ATG，終止密碼子為TAA。BtFAEl蛋白的理論分子量為56. 51kDa，等電點(diǎn)為9. 63。
含有上述序列I及其開(kāi)放閱讀框架的多核苷酸的載體，以及用上述序列I及其開(kāi)放閱讀框架的多核苷酸轉(zhuǎn)化的生物細(xì)胞，均是本發(fā)明需要保護(hù)的內(nèi)容。
本發(fā)明基因的發(fā)現(xiàn)，使通過(guò)轉(zhuǎn)基因來(lái)調(diào)控芥酸合成成為可能，對(duì)于培育高芥酸的轉(zhuǎn)基因十字花科作物具有重要意義。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖I為非洲芥菜基因組DNA
圖2為BtFAEl基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為真核表達(dá)載體pYES-BtFAEl的構(gòu)建流程圖
圖4為載體pYES-BtFAEl的酶切圖譜
圖5為酵母中BtFAEl表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot分析具體實(shí)施方式
實(shí)施例I、基因BtFAEl的克隆
克隆BtFAEl，具體步驟如下
一、BtFAEl基因的獲得
非洲芥菜在正常條件下栽培，待真葉長(zhǎng)出，采集葉片，從葉片中提取DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終獲得BtFAEl基因。
I、非洲芥菜基因組DNA的提取
取新鮮幼嫩的活體植物葉片約O. 2g，在液氮冷凍條件下充分研磨，轉(zhuǎn)入I. 5mL的離心管中，加入500 μ LCTAB提取液，65°C水浴45min，期間顛倒混勻3次；加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戍醇，混合均勻，12000r · mirT1離心15min ;取上清,加2倍體積無(wú)水乙醇，-20°C冰箱中過(guò)夜；4000r · mirT1離心15min使DNA沉淀；700 μ L70%乙醇清洗2 次，4000r · mirT1離心lOmin，再用700 μ L無(wú)水乙醇清洗I次，4000r · mirT1離心IOmin,得 DNA沉淀晾干；最后加100 μ L去離子水使沉淀溶解。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖I所示。
2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR
以上述得到的非洲芥菜基因組DNA為模版，以分別帶有KpnI與BamHI酶切位點(diǎn)的 TFK (5' CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC 3')與 TRB(5' CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC)為引物，按以下反應(yīng)擴(kuò)增出BtFAEl基因。反應(yīng)體系如下
DNA 模版1·0μ1(2·0μβ) IO X PCR Buffer (含 Mg2+)2.0 μ dNTP0.3 μ (10 mM each) 引物 TFGpmol-L-1)2.0 μ
引物 TR^pmol·!/1)2.0 μ ExTaq DNA polymerase0.2 μ (5 U/μΙ) ddH2012.5 μ
按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng) 先94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性30sec，53°C退火 30sec，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，如圖2所示，有一大小約1500bp大小的條帶,與理論值相符。
回收1500bp的條帶，將該DNA片段連接到pMD18_T載體上，生成pMD_BtFAEl重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，經(jīng)測(cè)序后在GenBank中進(jìn)行Blastn比較，結(jié)果表明，該DNA與多種植物FAEl基因有較高的同源性，因此推測(cè)所擴(kuò)增的DNA為一個(gè)FAEl基因。測(cè)序后進(jìn)行 BLAST檢索，結(jié)果表明已分離得非洲芥菜FAEl基因序列。
二、BtFAEl基因的同源性分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
為將非洲芥菜的FAEl基因的蛋白序列與其他高等植物的FAEl基因編碼的蛋白進(jìn)行同源性分析，從NCBI網(wǎng)站上檢索到擬南芥(Arabidopsis thaliana),芥菜(Brassica juncea),歐洲油菜(Brassica napus),花椰菜(Brassica oleracea),完青(Brassica rapa), Camelina hispida, Cardamine graeca,海甘藍(lán)(Crambeabyssinica),蔣藍(lán)(Isatis tinctoria),綠獨(dú)行菜(Lepidium campestre),銀扇草(Lunaria annua),白芥(Sinapis alba),中歐芥(Teesdalia nudicaulis)等植物同源基因的蛋白序列。通過(guò)Megalign軟件分析結(jié)果表明非洲芥菜FAEl蛋白的氨基酸序列與歐洲油菜中FAEl蛋白的同源性達(dá) 96. 4%，與其它幾種植物的同源性在80% -90%左右，與擬南芥的FAEl蛋白同源性最低，僅為 80. 9%。
Pfam結(jié)果顯示BtFAEl基因所編碼蛋白具有典型的FAEl蛋白特有的FAE1_CUT1_ RppA 與 ACP_syn_III_C 結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例2、BtFAEl基因的功能驗(yàn)證
一、BtFAE I基因在酵母中的高效表達(dá)
為了表明BtFAEl基因的編碼功能，本發(fā)明將BtFAEl基因克隆到Invitrogen公司的pYES2/NT C的BamHI和KpnI位點(diǎn)之間，并轉(zhuǎn)化酵母菌株InvScl，獲得了高效表達(dá)。
本發(fā)明是利用Invitrogen公司的pYES2/NT C高效表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn) BtFAEl的高效表達(dá)的。本實(shí)驗(yàn)采用的酶切位點(diǎn)使pYES2/NT C表達(dá)載體表達(dá)出的產(chǎn)物5’端附加6個(gè)連續(xù)His的融合蛋白，這6個(gè)連續(xù)的His構(gòu)成了 i-NTA凝膠特異結(jié)合的位點(diǎn)，因此可利用親和層析來(lái)純化表達(dá)產(chǎn)物。
將攜帶BtFAEl基因的pMD_BtFAEl重組載體與pYES2/NT C表達(dá)載體用相同的酶 (BamHI和KpnI)酶切后，再連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化酵母InvScl菌株，并用添加了 2% (w/v) 葡萄糖但不含脲嘧啶的培養(yǎng)基上(SC-ura)培養(yǎng)并選擇。載體的構(gòu)建流程見(jiàn)圖3。經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定(如圖4所示)，1，2為質(zhì)粒pYES-BtFAEl用BamHI和KpnI酶切后，再經(jīng)過(guò)PCR鑒定后，將篩出的連接正確的重組子進(jìn)行測(cè)序，證明插入載體的DNA序列的閱讀框架是正確的。 把構(gòu)建成帶有BtFAEl基因的表達(dá)載體，命名為pYES-BtFAEl，用于誘導(dǎo)表達(dá)分析。
將篩選并經(jīng)鑒定確認(rèn)的重組子，接種到添加了 2% (w/v)葡萄糖的SC-ura液體培養(yǎng)基中，在28°C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用添加了 2% (w/v)半乳糖的SC-ura液體培養(yǎng)基將過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋到0D600值為O. 02，并繼續(xù)振蕩培養(yǎng)到0D600值為I. 4。收集菌體，按凱基公司提供的方法提取細(xì)胞總蛋白，然后用HisBind resin純化并進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳檢測(cè)， 結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，BtFAEl基因在InvSc中得到了高效表達(dá)。
二、功能鑒定
為檢測(cè)BtFAEl基因的功能，本發(fā)明采用對(duì)轉(zhuǎn)化有pYES-BtFAEl質(zhì)粒的酵母細(xì)胞的芥酸含量進(jìn)行測(cè)定，BtFAEl基因促進(jìn)了芥酸合成，芥酸在酵母細(xì)胞中得到累積。
本發(fā)明所采用的酵母菌株InvSc的脂肪酸延長(zhǎng)酶活性很低，只合成微量的超長(zhǎng)鏈脂肪酸，因此是研究FAEl編碼蛋白活性的常用體系。將步驟一中篩選并經(jīng)鑒定確認(rèn)的重組子，接種到添加了 2% (w/v)葡萄糖的SC-ura液體培養(yǎng)基中，在28°C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用添加了 2% (w/v)半乳糖的SC-ura液體培養(yǎng)基將過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋到0D600值為O. 02，并繼續(xù)振蕩培養(yǎng)到(》600值為1.4。收集菌體，用超純水洗滌。酵母細(xì)胞在80°C氫氧化鉀-甲醇溶液(10% (w/v)Κ0Η, 5% (v/v)H20 in methanol)中皂化2h。皂化后，樣品置于冰上冷凍，然后用正己烷洗滌，以去除未皂化物。剩余的水相用6mol/L HCl酸化。自由脂肪酸被萃取在正己烷中，抽真空去除溶劑。自由脂肪酸在2ml含1% H2S04的甲醇溶液中60°C甲基化Ih。 酵母脂肪酸甲酯(FAMEs)被萃取在正己烷中，抽真空去除溶劑，剩余物溶解在正己烷中用于氣相色譜分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化有PYES-BtFAEl質(zhì)粒的酵母中芥酸含量為2. 33±0. 38%, 作為對(duì)照的空質(zhì)粒PYES2/NT C無(wú)芥酸累積。結(jié)果證實(shí)了 BtFAEl基因編碼蛋白的體外活性。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酸延長(zhǎng)酶多肽，該多肽選自 (a)具有序列2氨基酸序列的多肽； (b)將序列2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加形成的具有脂肪酸延長(zhǎng)酶功能的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述脂肪酸延長(zhǎng)酶的編碼基因，其特征在于所述脂肪酸延長(zhǎng)酶的基因cDNA為下述核苷酸序列之一 (a)序列表中序列I的核苷酸序列； (b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的核苷酸序列； (c)編碼序列表中序列2蛋白氨基酸序列的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2任一所述的基因的重組表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求2任一所述的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.含有權(quán)利要求2任一所述的基因的工程菌。
6.權(quán)利要求I任一所述的蛋白在培育脂肪酸改良植物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2任一所述的基因在培育脂肪酸改良植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來(lái)源于非洲芥菜的脂肪酸延長(zhǎng)酶及其編碼基因BtFAE1。將該基因?qū)虢湍?，重組酵母芥酸含量達(dá)2.33±0.38％。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锝嫠徇z傳調(diào)控機(jī)制的研究以及提高植物的芥酸含量和相關(guān)性狀的改良具有重要的理論和實(shí)際意義，將在植物的芥酸基因基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102978176SQ201210413098
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者孫小芹, 杭悅宇, 李瑩, 李密密, 龐慧, 郭建林, 嚴(yán)琴琴 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所