一種梭菌發(fā)酵甜高粱糖汁產(chǎn)溶劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種梭菌發(fā)酵甜高粱糖汁產(chǎn)溶劑的方法，所述方法的步驟包括：菌種活化、種子液培養(yǎng)1、種子液培養(yǎng)2和發(fā)酵，其特征在于，所述種子液培養(yǎng)2和發(fā)酵在培養(yǎng)基為33-39℃的條件下接種，然后進行非厭氧發(fā)酵。本發(fā)明的方法實現(xiàn)了梭菌在非厭氧條件下大規(guī)模發(fā)酵甜高粱糖汁產(chǎn)溶劑，有利于工業(yè)化應(yīng)用，降低了工業(yè)成本，具有較高的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。
【專利說明】一種梭菌發(fā)酵甜高粱糖汁產(chǎn)溶劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，是關(guān)于一種梭菌發(fā)酵甜高粱糖汁產(chǎn)溶劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]產(chǎn)溶劑梭菌(Clostridiumspp.)是一類能夠利用鹿糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖等糖類物質(zhì)作為碳源進行細胞生長和代謝活動，并在其代謝過程中產(chǎn)生丙酮、丁醇和乙醇三聯(lián)產(chǎn)品的產(chǎn)孢子革蘭氏陽性菌，是溶劑發(fā)酵工業(yè)的最重要菌種來源。丙酮和丁醇可作為溶劑廣泛地用于化工、汽車、醫(yī)藥和食品等制造行業(yè)；丁醇還是一種優(yōu)于乙醇、生物柴油的新一代可再生燃料。在石油化工興起之前，利用產(chǎn)溶劑梭菌生產(chǎn)丙酮和丁醇的發(fā)酵工業(yè)曾是世界上僅次于酒精發(fā)酵的第二大生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。
[0003]傳統(tǒng)的溶劑發(fā)酵工業(yè)主要以玉米(包括其它淀粉作物)和糖蜜等為原料，經(jīng)丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.bei jerinckii)等厭氧發(fā)酵，同時獲得丙酮、丁醇和乙醇(Acetone-gutanol-￡thanol三聯(lián)產(chǎn)品)的生物加工過程,亦稱為“ABE發(fā)酵”。產(chǎn)溶劑梭菌發(fā)酵生成的總?cè)軇舛群腿軇┤煞种g的比例，往往隨菌種類別、發(fā)酵底物和發(fā)酵條件而異。常見的產(chǎn)溶劑梭菌有以下4種:丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetoInicum)? 產(chǎn)溶劑梭菌一般的A:B:E比例為3:6:1，A和B占溶劑的90%以上，故也稱為“AB發(fā)酵”。
[0004]傳統(tǒng)的淀粉總?cè)軇院矸蹫榛吓渲瓢l(fā)酵液，由于粘度高、溶氧及擴散性能都較差，因而很容易達到梭菌的厭氧生長環(huán)境。但以甜高粱糖汁為基料配制的培養(yǎng)基情況正好相反，由于甜高粱糖汁是液體培養(yǎng)基，流動性強，氧氣很容易滲透入培養(yǎng)基內(nèi)部，導致培養(yǎng)基氧含量較高。目前為止，文獻報道的所有糖類物質(zhì)(液體培養(yǎng)基)的發(fā)酵都只在實驗室規(guī)模進行，實驗室規(guī)模的小試發(fā)酵可通過厭氧箱或厭氧罐來保證厭氧環(huán)境，而工業(yè)大容量發(fā)酵罐中糖汁液體的厭氧發(fā)酵未有前人經(jīng)驗可循。雖然理論上可通過向發(fā)酵罐通氮氣的方法來盡量排除發(fā)酵罐和培養(yǎng)`基中的氧氣，但勢必會增加氮氣和配套設(shè)備的成本，不利于工業(yè)生產(chǎn)。因此，甜高粱糖汁發(fā)酵產(chǎn)總?cè)軇┦紫刃枰鉀Q非厭氧環(huán)境下菌種的接種、增殖和發(fā)酵問題，力求在現(xiàn)有淀粉總?cè)軇S成熟技術(shù)和設(shè)備基礎(chǔ)上，使甜高粱糖汁這類液體物質(zhì)發(fā)酵總?cè)軇┻_到與厭氧條件下一樣的溶劑濃度和生產(chǎn)效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]批式發(fā)酵和補料發(fā)酵與實驗室厭氧箱發(fā)酵相比，主要就是需要解決非厭氧環(huán)境下的梭菌接種和擴容培養(yǎng)問題，這是梭菌后續(xù)連續(xù)發(fā)酵的基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明的第一個目的在于提供一種梭菌發(fā)酵產(chǎn)溶劑的方法。
[0007]本發(fā)明的第二個目的在于提供所述方法用于梭菌發(fā)酵產(chǎn)溶劑的應(yīng)用。
[0008]作為本發(fā)明的第一個方面，一種梭菌發(fā)酵產(chǎn)溶劑的方法，所述方法的步驟包括:菌種活化、種子液培養(yǎng)1、種子液培養(yǎng)2和發(fā)酵,其特征在于,所述種子液培養(yǎng)2和發(fā)酵在培養(yǎng)基為33-39°C的條件下接種，然后進行非厭氧發(fā)酵。[0009]根據(jù)本發(fā)明，所述梭菌包括:丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌和糖乙酸多丁醇梭菌。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例,所述糖丁酸梭菌為Clostridium saccharobutylicumP262。
[0011]根據(jù)本發(fā)明，所述菌種活化的條件為:
[0012]活化溫度為:33_35°C ;活化時間為:10_24h ；
[0013]菌種活化的培養(yǎng)基組成:(NH4)2S042g/L，K2HPO4Ig/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4 ? 7H200.lg/L, FeSO4 ? 7H200.015g/L, CaCl20.01g/L, MnSO4 ? H2O0.01g/L, CoCl20.02g/L, ZnSO40.02g/L,胰蛋白胨2g/L,酵母提取物lg/L,葡萄糖20g/L,刃天青0.001g/L。
[0014]根據(jù)本發(fā)明，所述種子液培養(yǎng)I的條件為:
[0015]培養(yǎng)溫度為:33_35°C ;培養(yǎng)時間為:12_16h。
[0016]種子液培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成:甜高粱糖汁20-30g/L ；CaC03lg/L ； (NH4)2SO4L 5g/L ；pH5-7。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，所述種子液培養(yǎng)2的條件為:
[0018]培養(yǎng)溫度為:33_35°C ;培養(yǎng)時間為:12_16h。
[0019]種子液培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成:甜高粱糖汁20-30g/L ；CaC03lg/L ； (NH4)2SO4L 5g/L ；pH5-7。
[0020]根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵的條件為:
[0021]發(fā)酵溫度為:26_39°C ;發(fā)酵時間為:12_136h。
[0022]發(fā)酵的培養(yǎng)基組成:甜高粱糖汁40_60g/L ； CaCO31 g/L ； (NH4)2SO4L 5g/L ;pH5_7。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵為批式發(fā)酵或補料發(fā)酵。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵包括1-2個發(fā)酵罐發(fā)酵。
[0025]作為本發(fā)明的第二個方面，所述的梭菌發(fā)酵產(chǎn)溶劑的方法用于梭菌發(fā)酵產(chǎn)溶劑的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明的有益效果:
[0027]1、本發(fā)明解決了非厭氧環(huán)境下菌種的接種、增殖和發(fā)酵問題，接種時控制培養(yǎng)基溫度為33_39°C，保持在無氧或氧氣較少的條件下接種，然后進行發(fā)酵，結(jié)果顯示梭菌在流動性較強的甜高粱糖汁培養(yǎng)基中能夠較好地發(fā)酵產(chǎn)溶劑；
[0028]2、本發(fā)明的方法不需要通氮氣等額外的成本和勞動，操作簡便，成本低。
[0029]本發(fā)明的方法實現(xiàn)了梭菌在非厭氧條件下大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)溶劑，有利于工業(yè)化應(yīng)用，降低了工業(yè)成本，具有較高的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為梭菌Clostridium saccharobutylicum P262批式發(fā)酵產(chǎn)溶劑的產(chǎn)物結(jié)果。
[0031]圖2為梭菌Clostridium saccharobutylicum P262批式發(fā)酵產(chǎn)溶劑的殘?zhí)亲兓Y(jié)果。
[0032]圖3為梭菌Clostridium saccharobutylicum P262批式發(fā)酵產(chǎn)溶劑的溫度和pH
變化結(jié)果。
[0033]圖4為梭菌Clostridium saccharobutylicum P262補料發(fā)酵產(chǎn)溶劑的種母罐發(fā)酵的產(chǎn)物結(jié)果，其中，虛線代表補料。
[0034]圖5為梭菌Clostridium saccharobutylicumP262補料發(fā)酵產(chǎn)溶劑的種母罐發(fā)酵的溫度和PH變化結(jié)果，其中，虛線代表補料。
[0035]圖6為梭菌Clostridium saccharobutylicumP262補料發(fā)酵產(chǎn)溶劑的育種罐發(fā)酵的產(chǎn)物結(jié)果，其中，虛線代表第二次移種。
[0036]圖7為梭菌Clostridium saccharobutylicumP262補料發(fā)酵產(chǎn)溶劑的育種罐發(fā)酵的溫度和PH變化結(jié)果，其中，虛線代表第二次移種。
【具體實施方式】
[0037]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于實施本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0038]本發(fā)明中使用的菌株為Clostridium saccharobutylicum P262,購自德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)。
[0039]以下實施例中使用的CGM培養(yǎng)基配方如下:
[0040](NH4) 2S042g/L, K 2HPO41 g/L, KH2PO40.5g/L, MgSO4 ? 7H200.lg/L, FeSO4 ? 7H200.015g/L, CaCl20.01g/L, MnSO4 ? H2O0.01g/L, CoCl20.02g/L, ZnSO40.02g/L，胰蛋白胨 2g/L，酵母提取物lg/L,葡萄糖20g/L,刃天青0.001g/L。
[0041]以下實施例中使用的甜高粱糖汁種子培養(yǎng)基配方如下:
[0042]甜高粱糖汁20-30g/L, (NH4)2SO4L 5g/L，CaCO31 g/L, pH5_7。
[0043]以下實施例中使用的甜高粱糖汁發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:
[0044]甜高粱糖汁40_60g/L，(NH4)2SO4L 5g/L，CaCO31 g/L, pH5_7。
[0045]溶劑和酸以氣相色譜內(nèi)標法測定，異丁醇和異丁酸做內(nèi)標，以配置有Grace公司ECTM-WAX毛細管色譜柱的安捷倫7890型氣相色譜儀進行測定。進樣量I U 1，分流比25:1。分析條件為:柱溫85°C，氮氣5ps1.，5.5min后，升溫至150°C;氮氣30psi，保持3分鐘，氫氣30mL/min,空氣400mL/min，尾吹25mL/min ;進樣區(qū)溫度250°C，氫火焰檢測區(qū)溫度為300°C。
[0046]糖以液相色譜法(HPLC)測定，分析方法如下:取樣品清液，用無離子水稀釋20倍，以配置有suger-parkl色譜柱的安捷倫2100型液相色譜儀進行測定。進樣量5 u L，柱溫700C，0.6mL/min流速，水相，視差檢測器溫度55°C。
[0047]實施例1、梭菌批式發(fā)酵產(chǎn)溶劑
[0048]1.1、種母罐中試發(fā)酵
[0049]菌種活化:取50iiL Clostridium saccharobutylicum P262 甘油管菌種接入 5mLCGM培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)10-24h，培養(yǎng)溫度為33-35°C。最佳狀態(tài)種子液的0D_約0.8-1.0，此時生長旺盛，大量產(chǎn)氣。
[0050]種子液培養(yǎng)1:取3mL CGM培養(yǎng)液接入300mL甜高粱糖汁培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 33-35°C。
[0051]種子液培養(yǎng)2:12h后分別取60mL甜高粱糖汁培養(yǎng)液接入滅菌后冷卻至33_35°C的6L甜高粱糖汁培養(yǎng)基/10L瓶中(即接種量為l%(v/v，下同))，加蓋硅膠塞后置于普通培養(yǎng)箱，33°C培養(yǎng)約16h后，將6L培養(yǎng)物用于種母罐接種。
[0052]種母罐培養(yǎng)基配料為:初糖濃度:49.76g/L(含蔗糖5.67g/L，葡萄糖17.55g/L，果糖 26.54g/L) ；CaCO3:lg/L ； (NH4)2SO4:1.5g/L ;初始 pH5.1 ;物料量:2.36m3。
[0053]初始發(fā)酵條件為:種母罐培養(yǎng)基接種溫度:38.80C。
[0054]24h后種母罐溫度降至33 °C，48h時罐溫為29.7 V。
[0055]種母罐接種后，每隔一定時間取樣一次，分析溶劑、酸、殘?zhí)?、pH，溫度由中試車間DCS在線記錄。整個發(fā)酵過程的各參數(shù)變化情況如圖1-3所示。
[0056]溶劑生產(chǎn)情況如圖1所示，溶劑在42h后趨于穩(wěn)定，最終產(chǎn)溶劑16.53g/L(其中丙酮6.93g/L,乙醇0.58g/L, 丁醇9.02g/L), 丁醇比例約占55%。殘?zhí)亲兓闆r如2所示，42h后葡萄糖和蔗糖基本被耗完，剩余3g/L果糖，糖利用率為94%，溶劑-糖轉(zhuǎn)化率為0.33g/g糖。溫度和PH變化情況如圖3所示，因種母罐無恒溫裝置，隨著發(fā)酵時間延長，溫度從最初的約39°C下降到72h的26°C，pH變化符合溶劑發(fā)酵的一般規(guī)律，即先產(chǎn)酸然后酸被回用。
[0057]從圖1可知，發(fā)酵42h已達終點。以此計算生產(chǎn)強度為:16.53g/L + 42h=0.393g/L ? h0
[0058]由以上結(jié)果可知，當接種溫度為38.8°C時，梭菌Clostridium saccharobutylicumP262在非厭氧條件下培養(yǎng)能夠正常發(fā)酵產(chǎn)溶劑，當發(fā)酵42h時，糖被大部分利用完，總?cè)軇┊a(chǎn)量為16.53g/L，其中丁醇比例為55%。
[0059]1.2、對照
[0060]以中試種母罐相同的6L培養(yǎng)物為種子，在實驗室同步進行一個6L瓶的對照發(fā)酵，接種量為0.5%，于33°C普通培養(yǎng)箱恒溫發(fā)酵。68h的各參數(shù)變化情況如表1所示。
[0061]表1、6L瓶培養(yǎng)基發(fā)酵68h結(jié)果`
【權(quán)利要求】
1.一種梭菌發(fā)酵甜高粱糖汁產(chǎn)溶劑的方法，所述方法的步驟包括:菌種活化、種子液培養(yǎng)1、種子液培養(yǎng)2和發(fā)酵，其特征在于，所述種子液培養(yǎng)2和發(fā)酵在培養(yǎng)基為33-39°C的條件下接種，然后進行非厭氧發(fā)酵。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述梭菌包括:丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌和糖乙酸多丁醇梭菌。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖丁酸梭菌為ClostridiumsaccharobutyIicum P262。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌種活化的條件為: 活化溫度為:33-35°C ;活化時間為:10-24h ；
菌種活化的培養(yǎng)基組成:(NH4) 2S042g/L，K2HPO41g/L, KH2PO40.5g/L，MgSO4 ? 7H200.lg/L，F(xiàn)eSO4 ? 7H200.015g/L, CaCl20.01g/L, MnSO4 ? H2O0.01g/L, CoCl20.02g/L, ZnSO40.02g/L，胰蛋白胨2g/L,酵母提取物lg/L,葡萄糖20g/L,刃天青0.001g/L。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述種子液培養(yǎng)I的條件為: 培養(yǎng)溫度為:33-35°C ;培養(yǎng)時間為:12-16h。 種子液培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成:甜高粱糖汁20-30g/L ；CaC03lg/L ； (NH4) 2S041.5g/L ；pH5-7。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述種子液培養(yǎng)2的條件為: 培養(yǎng)溫度為:33-35°C ;培養(yǎng)時間為:12-16h。 種子液培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成:甜高粱糖汁20-30g/L ；CaC03lg/L ； (NH4) 2S041.5g/L ；pH5-7。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵的條件為: 發(fā)酵溫度為:26-39°C ;發(fā)酵時間為:12-136h。 發(fā)酵的培養(yǎng)基組成:甜高粱糖汁 40-60g/L ；CaC03lg/L ； (NH4)2SO4L 5g/L ;pH5_7。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵為批式發(fā)酵或補料發(fā)酵。
9.如權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵包括1-2個發(fā)酵罐發(fā)酵。
10.如權(quán)利要求1-9任一項所述的方法的應(yīng)用，其特征在于，用于梭菌發(fā)酵甜高粱糖汁產(chǎn)溶劑。
【文檔編號】C12P7/28GK103773816SQ201210413833
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月25日
【發(fā)明者】戎幫雄, 李治林, 邵麗君, 楊晟, 張志剛, 楊蘊劉, 蔣宇, 陳軍, 姜衛(wèi)紅 申請人:上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心, 興安盟博源生物能源有限公司