專利名稱：一種利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)活性膜蛋白的方法
一種利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)活性膜蛋白的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程及酶技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種膜蛋白的活性表達(dá)、酶學(xué)功能及其科研用途。
背景技術(shù)：
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì)1)特有的強(qiáng)有力的AOX (醇氧化酶基因)啟動(dòng)子，甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)，且甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜；2)表達(dá)水平高，即可在胞內(nèi)表達(dá)，又可分泌型表達(dá)；3)發(fā)酵工藝成熟，易放大；4)培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離；5)外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失；6)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生 物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)PichiaPink 相較于普通的巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)多了以下的幾個(gè)優(yōu)勢(shì)利用腺嘌呤營養(yǎng)缺陷型(敲除ADE2基因)進(jìn)行篩選，避免了抗性篩選的繁瑣；敲除蛋白酶P印4和/或prbl基因，減少了目標(biāo)蛋白的降解；針對(duì)不同的蛋白具有不同的載體進(jìn)行選擇，有低拷貝載體、高拷貝載體，和一個(gè)帶有a-mating signal信號(hào)肽基因的高拷貝載體，其中帶有信號(hào)肽的高拷貝載體PPink a-HC特別適合于將可溶蛋白分泌至胞外，有利于后期的蛋白純化，另外也可以保證膜蛋白的定位，以保證其活性發(fā)揮，這也避免了將基因在大腸桿菌中重組表達(dá)時(shí)，因蛋白定位失敗而失活的情況。具有產(chǎn)共軛亞油酸(CLA)的乳酸菌已得到了廣泛報(bào)道，如羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌等產(chǎn)CLA的效率很高。動(dòng)物雙歧桿菌ΒΒ-12是其中的一種細(xì)菌，該菌是現(xiàn)有技術(shù)已知的細(xì)菌(例如參見劉勇，張勇，包艷，張和平.4株益生菌的表面特性及抑制致病菌作用研究.中國食品學(xué)報(bào).2010.第二期2;王記成，郭壯，聞I 雅，劉小鳴，陳衛(wèi)，張和平·益生菌Lactobacillus casei Zhang與商業(yè)益生菌對(duì)胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)耐受性及發(fā)酵特性的比較.中國食品學(xué)報(bào).2009.第5期)，可通過商業(yè)購買獲得。該菌可將50%的底物亞油酸(LA)轉(zhuǎn)化為CLA，且所產(chǎn)的CLA中具有生物活性的順9，反Il-CLA的含量超過50%。盡管乳酸菌產(chǎn)共軛亞油酸的國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道已有很多，但乳酸菌產(chǎn)CLA的機(jī)理尚不明確，特別是在催化反應(yīng)的酶很可能是膜蛋白的情況下，相關(guān)的研究進(jìn)展十分緩慢，利用相關(guān)微生物進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的進(jìn)展目前幾乎為零，營養(yǎng)學(xué)家們正在想方設(shè)法擴(kuò)大共軛亞油酸的產(chǎn)量以便用于醫(yī)療或保健食品。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于根據(jù)現(xiàn)有膜蛋白活性表達(dá)較困難的問題，對(duì)來自于動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)提供一種重組的活性表達(dá)的方法，所述方法在PichiaPink 表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA。在重組表達(dá)雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原的方法時(shí)以動(dòng)物雙歧桿菌BB-12基因組為模板，以 5’ -CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3’，5’ -CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3’為引物，通過高保真PCR擴(kuò)增的方法得到MCRA蛋白的編碼基因。在得到MCRA蛋白的編碼基因后，將編碼基因與具有信號(hào)肽的載體pPinka-HC連接得到pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒，然后用pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化PichiaPink ，轉(zhuǎn)化成功的PichiaPink 菌表達(dá)動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA。本發(fā)明的另一目的還涉及一種重組表達(dá)雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原的宿主，該宿主為pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的PichiaPink 菌，其中的pP i nk a -HC-MCRA質(zhì)粒是將雙歧桿菌BB-12的MCRA編碼基因與具有信號(hào)肽的載體pPinka-HC連接得到的。本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供上述膜蛋白或活性表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，可以將獲得的雙 歧桿菌BB-12肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原或宿主用于制備共軛亞油酸。本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明從動(dòng)物雙歧桿菌BB-12中克隆獲得肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原(MCRA)基因，并實(shí)現(xiàn)對(duì)其的活性表達(dá)的方法為將動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA，以具有信號(hào)肽的載體pPink a -HC在PichiaPink 表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，得到正確定位于細(xì)胞膜、具有活性的重組蛋白。上述制備方法步驟如下(I)以動(dòng)物雙歧桿菌 BB-12 基因組為模板，以 5’-CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3，，5，-CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3，為引物，通過高保真PCR擴(kuò)增的方法得到MCRA基因。PCR程序?yàn)?5°C 30s, 55°C 30s, 68°C 2. 5min，30 個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)體系5 μ L dNTPs(2mM)，5μ L10XK0D plus Buffer, I μ L KOD plus,2. 5μ L MgSO4 (25mM)，上游及下游引物各I μ L，模板2μ L ；(2)擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR V和Kpn I 37°C消化3h后，與經(jīng)Stu I和Kpn I酶切后的pPinka -HC質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化至E. coli T0P10感受態(tài)細(xì)胞并均勻涂布于LBA平板(含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板)，37°C過夜培養(yǎng)后，挑選單克?。?3)將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至PichiaPink 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于不含腺嘌呤的PAD選擇性平板，挑選單克?。?4)以甲醇誘導(dǎo)重組酵母菌，通過SDS-PAGE和Western Blot等方法驗(yàn)證目標(biāo)蛋白表達(dá)及定位情況，通過GC-MS對(duì)誘導(dǎo)后的菌體及培養(yǎng)基的脂肪酸組成進(jìn)行鑒定以測(cè)定目標(biāo)蛋白的活性。本發(fā)明動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的MCRA蛋白順利地定位至細(xì)胞膜。本發(fā)明雙歧桿菌BB-12的MCRA蛋白能夠在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)PichiaPink 中表達(dá)，表達(dá)獲得的MCRA蛋白具有活性，能夠催化亞油酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基化衍生物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)蛋白在畢赤酵母中既實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)，又實(shí)現(xiàn)了定位至細(xì)胞膜。


圖I為MCRA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。I為PCR產(chǎn)物，2為陰性對(duì)照；圖2為pPinka-HC-MCRA質(zhì)粒驗(yàn)證圖。I為以重組質(zhì)粒作模板的PCR擴(kuò)增，2為以基因組作陽性對(duì)照，3為以空pPink a -HC質(zhì)粒作陰性對(duì)照；圖3為重組畢赤酵母PichiaPink pPink a -HC-MCRA重組子驗(yàn)證圖。I為原始菌基因組作陰性對(duì)照，2為整合子基因組為模板，3為以相應(yīng)質(zhì)粒作陽性對(duì)照?qǐng)D4 為重組 PichiaPinkTM 菌的 SDS-PAGE (A)和 Western Blot (B)圖。I 為畢赤酵母菌發(fā)酵液上清樣品，2為畢赤酵母菌菌體樣品；圖5為未添加底物時(shí)重組PichiaPink 菌的菌體及發(fā)酵液上清脂肪酸GC-MS檢測(cè)GC結(jié)果圖。A、B分別為對(duì)照菌的菌體及發(fā)酵液上清脂肪酸檢測(cè)結(jié)果，C、D分別為重組菌的菌體及發(fā)酵液上清脂肪酸檢測(cè)結(jié)果；
圖6為添加底物時(shí)重組PichiaPink 菌的菌體及發(fā)酵液上清脂肪酸GC-MS檢測(cè)GC結(jié)果圖。A、B分別為對(duì)照菌的菌體及發(fā)酵液上清脂肪酸檢測(cè)結(jié)果，C、D分別為重組菌的菌體及發(fā)酵液上清脂肪酸檢測(cè)結(jié)果；圖7為產(chǎn)物的MS實(shí)際及理論碎片。
具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例I轉(zhuǎn)入動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的MCRA基因的PichiaPink 重組菌的建立。(I)試驗(yàn)方法以動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的基因組為模板，根據(jù)動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的MCRA序列(GenBank ADC85468)設(shè)計(jì)引物，用高保真的KOD plus酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增MCRA基因。以 5’ -CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3’，5’ -CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3’為引物，通過高保真PCR擴(kuò)增的方法得到MCRA基因。PCR 程序?yàn)?5V 30s, 55 °C 30s, 68 °C 2. 5min，30 個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)體系5μ L dNTPs (2mM)，
5μ LlO X KOD plus Buffer, I μ L KOD plus, 2. 5μ L MgSO4 (25mM)，上游及下游引物各 I μ L，模板2yL。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR V和Kpn I37°C消化3h后，與經(jīng)Stu I和Kpn I酶切后的pPinka-HC質(zhì)粒以合適的比例連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli T0P10感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布于LBA平板(含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板)，37°C過夜培養(yǎng)進(jìn)行篩選。挑選轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確的重組質(zhì)粒pPink a-HC-MCRA。用電轉(zhuǎn)化儀將經(jīng)Spe I酶切后的線性化pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至PichiaPink 菌感受態(tài)細(xì)胞，通過PAD選擇性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化菌株。挑取轉(zhuǎn)化子，以重組畢赤酵母菌的基因組為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選出同源重組正確的重組菌和轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的對(duì)照菌。同時(shí)保存篩選出的同源重組正確的重組菌，作為擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種。(2)結(jié)果PCR克隆片段的長度與MCRA基因本身的長度相匹配，表示成功克隆MCRA基因(見圖I)，MCRA基因成功連接到pPinka-HC質(zhì)粒上(見圖2)，質(zhì)粒后經(jīng)上海桑尼生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示MCRA基因完全正確(GenBank :ADC85468)。MCRA基因與pPink a -HC質(zhì)粒連接所得到的pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒成功整合至PichiaPinkTM菌的基因組中，同時(shí)得到了整合了空質(zhì)粒pPinka-HC的PichiaPinkTM對(duì)照菌(見圖3)，其中pPinka-HC質(zhì)粒和PichiaPink 表達(dá)系統(tǒng)購自 Invitrogen。實(shí)施例2I動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的MCRA基因在PichiaPink 重組菌中表達(dá)的確定。I. I實(shí)驗(yàn)方法重組菌及對(duì)照菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，對(duì)菌體及培養(yǎng)基部分的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 和 Wester Blot 檢驗(yàn)。(I)溶液配制BMGY培養(yǎng)基1%酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀緩沖液pH6. O, I. 34%YNB，O. 0004%生物素，1%甘油；將BMGY中的甘油用1%甲醇替代即得BMMY培養(yǎng)基；(2)重組菌和對(duì)照菌于BMGY培養(yǎng)基中28°C、250rpm條件下培養(yǎng)2天，后1500g離 心5min，去除BMGY培養(yǎng)基，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，于28°C、250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)2天后，分別取發(fā)酵液、菌體進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析，分離膠濃度為12%。(3) SDS-PAGE 及 Western Blot將10 μ g樣品在兩塊12%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，80V濃縮25min，再150V分離6(T80min。其中一塊用考馬斯亮藍(lán)染色和醋酸-乙醇溶液脫色，在凝膠呈像系統(tǒng)上分析蛋白分布與濃度。將另一塊膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，后依次結(jié)合一抗(抗His的抗體)和二抗(Horseradish peroxidase (HRP) -conjugated anti-mouse IgG),最后用增強(qiáng)型突光試劑盒進(jìn)行處理及顯影。I. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果SDS-PAGE及Western Blot分析顯示重組基因在PichiaPinkTM重組菌中得到表達(dá)，且定位于細(xì)胞膜，分子量為82kDa (見圖4)。2、動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的MCRA蛋白在PichiaPink 重組菌中活性的確定。(I)試驗(yàn)方法重組菌及對(duì)照菌按上述方法誘導(dǎo)I天后，一組添加底物亞油酸，一組不添加亞油酸，繼續(xù)誘導(dǎo)I天后，收菌凍干，菌體凍干粉按文獻(xiàn)方法(Sakuradani E,Shimizu S.Gene cloning and functional analysis of a second Δ 6-fatty aciddesaturase from an arachidonic acid-producing Mortierella fungus. Biosci BiotechBioch 2003,67:704 - 711)進(jìn)行脂質(zhì)提取。向200mg菌體凍干粉中加入十九烷酸內(nèi)標(biāo)和10%的鹽酸-甲醇溶液，600C，孵育3h。后加入正己烷和飽和NaCl，振蕩混勻，離心后上清于干凈的瓶中；重復(fù)提取一次；N2吹干后用重氮甲烷補(bǔ)充甲酯化，N2吹干后用正己烷回溶，用于GC-MS檢測(cè)分析。ImL發(fā)酵后培養(yǎng)液也按相同方法進(jìn)行脂質(zhì)提取及甲酯化處理。GC-MS條件Finnigan Trance GC/Finnigan Trance MS (美國 Thermo),色譜柱Agilent DB-ffAX(30mX0. 250mm idXO. 25 μ m，美國安捷倫)。GC 升溫程序180°C保持 0. 5min，后以 5°C /min的升溫速率升至230°C,保持13min。載體流量He 8mL/min,載氣流量He 8mL/min,氣化室溫度250°C，進(jìn)樣量10 μ L，分流比62:1。質(zhì)譜檢測(cè)條件離子化方式ΕΙ，電離電壓70eV ;發(fā)射電流200 μ A ;柱上溫度250°C ;離子室溫度230°C ;檢測(cè)器電壓350V。(2)試驗(yàn)結(jié)果僅在添加底物亞油酸時(shí),重組菌的菌體內(nèi)檢測(cè)到相應(yīng)的產(chǎn)物,產(chǎn)物為10-羥基-順-12-十八碳烯酸，即10-H0E (見圖5，圖6，圖7)。結(jié)果表明重組菌表達(dá)的MCRA蛋白能夠?qū)営退徂D(zhuǎn)化成共軛亞油酸10-羥基-順-12-十八碳烯酸的能力，而對(duì)照菌不具備這種能力。
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原的方法，其特征在于在PichiaPink 表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組表達(dá)雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原的方法，其特征在于該方法還包括以動(dòng)物雙歧桿菌BB-12基因組為模板，以5’-CCGGATATCATGGACACTAGGGCGCCGAAAGTCG-3’，5’ -CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCGCCGAATCATTCTCCCCCG-3’為引物，通過高保真PCR擴(kuò)增的方法得到MCRA蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原的方法，其特征在于該方法還包括在得到MCRA蛋白的編碼基因后，將編碼基因與具有信號(hào)肽的載體PPink a -HC連接得到pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒，然后用pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化PichiaPink ，轉(zhuǎn)化成功的PichiaPink 菌表達(dá)動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的膜蛋白MCRA。
4.一種重組表達(dá)雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原的質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒為 pPink a -HC-MCRA。
5.一種重組表達(dá)雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原的宿主，其特征在于，該宿主為pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的PichiaPink 菌，其中的pPink a -HC-MCRA質(zhì)粒是將雙歧桿菌ΒΒ-12的MCRA編碼基因與具有信號(hào)肽的載體pPink a -HC連接得到的。
6.雙歧桿菌ΒΒ-12肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)蛋白用于制備共軛亞油酸的用途。
7.權(quán)利要求4所述的質(zhì)?；驒?quán)利要求5所述的宿主用于制備共軛亞油酸的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)活性膜蛋白的方法。本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)雙歧桿菌BB-12的肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原的方法及以及在所述方法中使用的表達(dá)宿主，所述表達(dá)宿主是pPinkα-HC-MCRA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的PichiaPinkTM表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及雙歧桿菌BB-12肌球蛋白交叉反應(yīng)(MCRA)抗原或表達(dá)宿主用于制備共軛亞油酸的用途。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102876708SQ20121041448
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日 公開號(hào)201210414486.發(fā)明者陳海琴, 陳衛(wèi), 楊波, 田豐偉, 趙建新, 宋元達(dá), 陳永泉, 張灝 申請(qǐng)人:江南大學(xué)