專利名稱：中慢生根瘤菌zy1及其在土壤修復中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領域，尤其涉及一種中慢生根瘤菌ZYl及其在多氯聯(lián)苯污染土壤修復中的應用。
背景技術(shù)：
多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls, PCBsMtS—類典型的持久性有機污染物(Persistent organic Pollutants, POPs),廣泛分布于各類環(huán)境介質(zhì)中，土壤被認為是PCBs最大的庫和匯。PCBs污染土壤的微生物修復技術(shù)中需要解決的首要問題是高效降解菌株的篩選和構(gòu)建。1973年Ahmed和Focht篩選出兩株對齒代聯(lián)苯具有降解效果的無色桿菌(Achromobacter)以來，已分離出多種具有PCBs降解功能的細菌菌株。滕應等(2005,2006)研究發(fā)現(xiàn)了 PCBs復合污染土壤中存在部分優(yōu)勢革蘭氏陰性降解菌，如鞘氨醇單胞菌等。但是，有關(guān)能降解PCBs的根瘤菌種質(zhì)資源很少被發(fā)現(xiàn)。目前關(guān)于紫云英根瘤菌對PCBs污染土壤的修復效果尚無報道。鑒此，本專利從PCBs污染農(nóng)田的紫云英根瘤中分離篩選出一株對PCBs具有良好降解性能的中慢生根瘤菌ZYl，研究了紫云英根瘤菌對PCBs復合污染農(nóng)田土壤的修復效應，為進一步研發(fā)PCBs污染土壤的生物修復提供了科學依據(jù)和新思路，具有十分廣泛的應用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于針對生產(chǎn)實踐中的實際問題和需求，提供了一種能夠降解多氯聯(lián)苯(如PCB77)的微生物資源。技術(shù)方案一種中慢生根瘤菌(Mesorhizobium sp. strain ZYl),該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年9月25日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號CGMCC No. 6622。中慢生根瘤菌(Mesorhizobium sp. strain ZYl)在多氯聯(lián)苯污染土壤中的修復應用。中慢生根瘤菌(Mesorhizobium sp. Strain ZYl)在多氯聯(lián)苯污染土壤修復中的應用。中慢生根瘤菌(Mesorhizobium sp. strain ZYl)的培養(yǎng)基，按質(zhì)量比組成為NaCl I. OOg, NH4NO3 I. OOg,K2HPO4 I. 50g，KH2PO4 O. 50g，MgSO4. 7H20 0. 50g，添加 PCB77 (3，3’，4，4’ -四氯聯(lián)苯)，使其濃度達到 15mg/L, ρΗ7· 0 7· 5。本發(fā)明提供一種多氯聯(lián)苯的降解菌，其菌株是一株革蘭氏陰性菌ZYl (2012年9月25日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNo. 6622)，經(jīng)鑒定為中慢生根瘤菌(Mesorhizobium sp.)。ZYl在甘露醇酵母汁瓊脂培養(yǎng)基(YMA)培養(yǎng)基(按質(zhì)量配比為甘露醇10. Og，酵母粉O. 4g，K2HPO4 O. 5g，MgSO4 O. 2g，NaCl
O.2g，微量元素溶液lmL，加超純水至1L，ρΗ7. (Γ7. 2。微量元素溶液(g/L) =H3BO3 2. 86g，MnSO4 I. 81g, ZnSO4 O. 22g, CuSO4 0. 80g, H2MoO2 0. 02g)平板上培養(yǎng) 24h 后，菌落乳白色、圓形、黏質(zhì)半透明、邊緣整齊、表面隆起、濕潤光滑，菌落直徑一般在I. (Γ2. 5mm。經(jīng)染色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性，菌體呈長桿狀(0.5、. 6 μ mX I. 8 3.8 μ m)(見圖2、圖3)。
該菌具有較高的降解多氯聯(lián)苯的能力。將降解多氯聯(lián)苯的Mesorhizobiumsp. strain ZYICGMCC No. 6622菌株接種于甘露醇酵母汁瓊脂培養(yǎng)基(YMA)搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；將上述培養(yǎng)好的菌種按10%vt的接種量接種入500mL三角瓶，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。該菌株ZYl能以PCBs為唯一碳源生長，并對溶液中PCB77具有較高的降解效率。在15mg/L初始濃度條件下，第4d、第7d、第IOd時其降解率分別達到了 45. 3%、51. 0%和62. 7%?？梢姡摼陮Χ嗦嚷?lián)苯具有較好的降解作用(見圖6)。將Mesorhizobium sp. strain ZYl CGMCC No. 6622 菌液按 20 % wt 的接種量接入多氯聯(lián)苯污染土壤中，28°C避光培養(yǎng)28d后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，接種活菌ZYl顯著促進了污染土壤中 PCBs (包括 PCB8，PCB18, PCB28, PCB44, PCB52, PCB66, PCB77, PCBlOl，PCB105,PCB118,PCB126,PCB128,PCB138,PCB153,PCB170,PCB180,PCB187,PCB195,PCB200,PCB206,PCB209)總量的降低，在第0、4、7、14、28d，土壤中PCBs殘留量分別為9409. 22 μ g/kg,8151. 84 μ g/kg、4348. 65 μ g/kg、3945. 53 μ g/kg 和 3550. 78 μ g/kg，在第 28d 降解率達到了 57. 6% (見圖7 圖8)。該菌株在PCBs污染土壤的生物修復中具有良好的應用前景。
本發(fā)明提供的Mesorhizobium sp. strain ZYICGMCC No. 6622 菌株能在 PCB77(3，3’，4，4’_四氯聯(lián)苯)為唯一碳源和能源的無機鹽基礎培養(yǎng)基中生長并降解利用高分子量PCB77，其培養(yǎng)基質(zhì)量比組成為NaCl L OOg，NH4NO3 I. 00g, K2HPO4 I. 50g, KH2PO4 0. 50g，MgSO4. 7H200. 50g，添加PCB77(3，3’，4，4’ -四氯聯(lián)苯)，使其濃度達到15mg/L，微量元素溶液I. OmL, ρΗ7. (Γ7. 5。121°C滅菌 30min。有益效果該菌株為中慢生根瘤菌(Mesorhizobium sp. strain ZYl CGMCCNo. 6622)，游離態(tài)根瘤菌ZYl能夠以四氯聯(lián)苯PCB77 (3，3’，4，4’-四氯聯(lián)苯)為唯一碳源對其進行好氧降解，在以PCB77 (15mg/L)為唯一碳源的基礎鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)IOd后，其對PCB77的降解率達62. 7%。該菌接種于土壤28d后，土壤PCBs的降解率可達57. 6%，明顯提高了污染土壤中細菌和聯(lián)苯降解菌的數(shù)量，而且該根瘤菌與紫云英聯(lián)合作用后土壤中多氯聯(lián)苯去除率為53. 1%，該菌株在PCBs污染土壤的生物修復中具有較好的應用前景。


圖I為紫云英植株及其根瘤形態(tài)，其中a:紫云英田間長勢；b:紫云英植株；c:紫云英根系；d:紫云英根瘤；圖2為菌株ZYl在固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，其中a:平板上菌落生長；b:菌落形態(tài)；圖3為菌株ZYl的電鏡照片；(圖中左25000X，右12000X )；圖4為菌株ZYl的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；圖5為菌株ZYl的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹；圖6為菌株ZYl對PCB77的降解曲線；圖7為ZYl對污染土壤中PCBs含量的影響；圖8為不同處理下土壤中PCBs同系物百分含量；圖9為各處理土壤中聯(lián)苯降解菌數(shù)量的動態(tài)變化；圖10為不同處理下土壤PCBs遺傳毒性當量的變化。
具體實施例方式以下結(jié)合實例對本發(fā)明作進一步的描述實施例I :多氯聯(lián)苯降解紫云英根瘤菌的篩選鑒定及降解特性I. I材料與方法I. I. I供試材料改良基礎鹽培養(yǎng)基(降解培養(yǎng)基，MM,g/L) =NaCl I. 00g, NH4NO3 I. 00g, K2HPO4
I.50g, KH2PO4 O. 50g, MgSO4. 7H20 0. 50g，加超純水至 1L。ρΗ7· 0 7· 5。添加 PCB77 (3，3’，4,4’-四氯聯(lián)苯),使其濃度達到15mg/L,作為唯一碳源。
甘露醇酵母汁瓊脂培養(yǎng)基(YMA) (g/L):甘露醇10. 0g，酵母粉O. 4g，K2HPO4 O. 5g，MgSO4 O. 2g，NaCl O. 2g，微量元素溶液 lmL，加超純水至 IL0 ρΗ7· 0 7· 2，121°C滅菌 20min。微量元素溶液(g/L) =H3BO3 2. 86g，MnSO4 I. 81g，ZnSO4 0. 22g，CuSO4 0. 80g, H2MoO2 0. 02g。用2mol/L HCl和2mol/L NaOH溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH值在7. 0 7. 2，為了避免水中氯離子對實驗過程的影響，培養(yǎng)基采用超純水配制。主要化學品PCB77 (3，3’，4，4’-四氯聯(lián)苯)購自北京百靈威化學技術(shù)有限公司。丙酮、正己烷等有機溶劑均為分析純，重蒸后使用。硫酸為優(yōu)級純，無水硫酸鈉(分析純)、硅膠(10(Γ200目，分析純)、中性氧化鋁(分析純)400°C活化6h，冷卻后置于全玻璃容器中密封貯存，待用。另備色譜純正己烷、酸性硅膠(硅膠濃硫酸=2:1，質(zhì)量比)。提取DNA的試劑盒采用OMEGA的E. Z. N. A細菌DNA提取試劑盒。I. I. 2根瘤的獲取從長三角某典型多氯聯(lián)苯污染農(nóng)田土壤中生長狀態(tài)良好的紫云英植物根部選擇肥大、飽滿、粉紅色的有效根瘤，蒸餾水洗凈后無菌水沖洗數(shù)次，無菌濾紙吸干4°C保存待用，如圖I。I. I. 3降解根瘤菌的馴化、篩選根瘤菌分離方法參照文獻(Vincent, 1970)。先用95%wt乙醇浸泡2min,再用7%wt次氯酸鈉表面滅菌lOmin，然后用無菌水清洗10次。將單個根瘤在無菌條件下，用鑷子將其在盛有適量無菌水的離心管內(nèi)壓碎夾破后，將離心管內(nèi)無菌水和根瘤汁液接入IOOmL的以5mg/L PCB77為唯一碳源的基礎鹽培養(yǎng)液中(顧素芳等，1997)。30°C，170rpm好氧培養(yǎng)培養(yǎng)2 4d后，以1%的接種量連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接5次。富集培養(yǎng)液經(jīng)測定有降解效果后，提高富集培養(yǎng)液中PCBs的濃度至10mg/L，繼續(xù)富集。轉(zhuǎn)接5次經(jīng)測定有降解效果后，稀釋IO^lO6涂布150 μ L至YMA平板上，30°C培養(yǎng)。待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取單菌落劃線3 4次進行純化，純化后將菌株轉(zhuǎn)接至10mg/L PCB77為唯一碳源的基礎鹽培養(yǎng)液試管中，30 °C、170rpm搖培，分析單菌的降解效果。I. 1.4菌株的生理生化鑒定菌株形態(tài)及生理生化特性測定參照文獻(Dong等，2001)進行。測定指標包括9項甲基紅實驗(M. R.試驗)、乙酰甲基甲醇試驗(V. P.試驗)、接觸酶試驗(過氧化氫酶試驗)、氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、液化明膠試驗、檸檬酸利用試驗和糖酵解試驗(葡萄糖、乳糖)。I. I. 5菌株的16S rDNA分子鑒定菌株16S rDNA的克隆及序列測定和比較參照文獻(Sambrook等，1989)。將菌株ZYl轉(zhuǎn)接至YMA培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)，離心收集菌體，按照OMEGA的E. Z. N. A細菌DNA提取試劑盒提供的方法提取菌體總DNA。用細菌16S rDNA擴增通用引物(生工生物工程上海有限公司合成)對ZYl基因組進行PCR擴增。上游引物5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(Escherichia coli 對應位置為 8 27);下游引物5' -TACCTTGTTACGACTT-3' (E. coli 對應位置為1507 1492)。以ZYl總DNA為模板，50 μ L體系為模板I μ L，Premix rTaq(包括Taq 酶、Buffer、dNTP、Mg2+) 25 μ L，引物(20mmol/L)各 I μ L，超純水 22 μ L。聚合酶鏈式反應條件94°C, IOmin ；94°C,30s ；55°C,30s ；72°C, I. 5min ;循環(huán) 35 次，72°C延伸 IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠，于120V電泳30分鐘。PCR產(chǎn)物采Axygen凝膠回收試劑盒純化后酶連至PMD-18T載體(TAKARA公司)，轉(zhuǎn)化E · coliDH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，驗證插入片斷后測序(由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成)。將測序結(jié)果與GenBank中的16SrDNA序列進行同源性比較。I. I. 6菌株ZYl的溶液降解性能分析將滅菌的降解培養(yǎng)基(PCB77終濃度為15mg/L)，以每瓶5mL分裝在60mL玻璃離心 瓶(用黑色膠布進行避光處理，先塞上橡皮塞，再用錫箔紙包裹)中待用。挑取YMA平板活化的單菌落于50mLYMA液體培養(yǎng)基中，30°C、170rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，8000rpm離心5min收集菌體，用PH7. O的O. 05mol/L磷酸緩沖液洗滌2次后重懸，并調(diào)節(jié)0D_至I. O作為降解試驗的接種菌液。向降解培養(yǎng)基中接種ImL菌懸液，設接種滅活菌懸液處理為對照(CK)。將離心瓶放于28°C、170rpm搖床培養(yǎng)10天,分別在第0d、第4d、第7d、第IOd時取樣,測定其PCBs濃度和菌的生長情況(0D600nm)。I. 1.7轉(zhuǎn)化液中PCBs的提取和測定取樣后先加入100 μ L高氯酸終止反應。萃取相用色譜級的正己烷，按照每ImL樣品中加入3mL (三倍體積)的正己烷萃取，加入O. 4g硫酸銨作破乳劑，渦旋振蕩2min，靜置lh。待樣品分層穩(wěn)定后，取上層有機相轉(zhuǎn)移到玻璃離心管中，并加入O. 4g無水硫酸鈉脫水，取ImL用正己烷定容至5mL待GC分析。每批樣品設3組平行數(shù)據(jù)。用已知濃度的標準品檢測樣品回收率，其平均回收率達到95%。表明該方法能夠滿足實驗要求。色譜條件采用帶有電子俘獲檢測器和自動進樣器的Varian 3800型氣相色譜儀分析。色譜柱CP-sil24CB (30mX0. 25_X0. 25um)，進樣溫度為260°C，檢測器溫度為300°C。程序升溫初始溫度為180°C，保留O. 5min,30°C /min梯度升溫至260°C，持續(xù)18min,然后15°C/min梯度升溫至270°C,持續(xù)2min。無分流進樣I μ L,載氣為高純氮,流速為 I. OmT,/miη。質(zhì)量控制采用七點校正進行標準物質(zhì)的校正曲線和外標法進行，借助StarworkStation6. O進行數(shù)據(jù)采集和處理。21種PCBs混標(10 μ g/kg)的基質(zhì)加標平均回收率是72. 0 109· 8%，相對標準偏差是3. 1% 57. 3%，儀器檢測限為I. 43 5. 10 μ g/kg,方法檢出限為I. 33^3. 45 μ g/kg。該方法滿足痕量有機物定量分析要求。數(shù)據(jù)處理方法降解率(％)=(滅菌處理溶液濃度-活菌處理溶液濃度)/滅菌處理溶液濃度X 100%。1.2.結(jié)果與討論I. 2. I菌株ZYl的菌落形態(tài)特征通過分離純化從紫云英根瘤中篩選得到4株根瘤菌，將其中一株能較好降解PCBs的菌編號為ZYl。ZYl在YMA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24h后，菌落乳白色、圓形、黏質(zhì)半透明、邊緣整齊、表面隆起、濕潤光滑，菌落直徑一般在I. (Γ2. 5mm (圖2)。菌體革蘭氏染色呈陰性，在掃描電鏡下可見菌體呈長桿狀(O. 5^0. 6 μ mX I. 8^3. 8 μ m),因生長時期的不同，大小略有差異，單根極生鞭毛(圖3)。I. 2. 2菌株ZYl的生理生化特征菌株ZYl的生理生化特性測定結(jié)果見表I. I。由表I. I可知，菌株ZYl的甲基紅和V. P.反應陽性，過氧化氫酶和接觸酶測定陽性，氧化酶測定陰性，不能利用硝酸鹽和檸檬酸鹽，能利用淀粉，不能液化明膠，吲哚試驗呈陰性，蔗糖、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，乳糖發(fā)酵不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。表I. I菌株ZYl的生理生化特征
試驗名稱試驗結(jié)果試驗名稱試驗結(jié)果
甲基紅試驗+淀粉利用情況+
V.P.反應+明膠液化試驗-
過氧化氫酶測定+吲咮試驗-
氧化酶測定-蔗糖、葡萄糖發(fā)酵試驗
硝酸鹽利用情況-乳糖發(fā)酵試驗-
桿檬酸鹽利用情況-I. 2. 3菌株ZYl的分子鑒定結(jié)果以菌株ZYl基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長度為1527bp的擴增產(chǎn)物，菌株ZYl的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示。測序工作委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。根據(jù)GeneBank序列同源性比較,菌株ZYl與Mesorhizobium sp. (GenBank登錄號為AM491622. I)同源性為99%，結(jié)合其形態(tài)特征和生理生化特性結(jié)果，初步將該菌鑒定為中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium sp.)。圖5是該菌株的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。I. 2. 4菌株ZYl的對PCB77的溶液降解性能菌株ZYl對溶液中PCB77的降解動態(tài)結(jié)果如圖6所示。從圖6可知，接入ZYl進行生物降解后，溶液中PCB77 (3，3’，4，4’ -四氯聯(lián)苯)降解率顯著增加，在第0、4、7、10d時降解體系中PCB77濃度分別為14. 58mg/L、6. 39mg/L、6. 07mg/L、5. 91mg/L。試驗組與對照組之間存在顯著差異(P < O. 05)，第4d、第7d和第10d，在15mg/L初始濃度條件下，該菌對PCB 77的降解率相對于滅菌對照分別達到了 45. 3%、51. 0%和62. 7%。在加入滅活菌液的對照組中，PCB77的濃度也有所下降，這可能是由于PCB77在提取純化過程中揮發(fā)或發(fā)生光解等非生物因素造成。實施例2 :紫云英根瘤菌對污染土壤中多氯聯(lián)苯的降解性能2. I材料與方法2. I. I供試材料供試菌株菌株中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumsp. strain ZYl CGMCC No. 6622),從長江三角洲某典型PCBs污染農(nóng)田的紫云英植株根瘤中，經(jīng)馴化富集后分離篩選得到。先將菌種接種于YMA固體平板培養(yǎng)基上28°C活化，然后接入YMA液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，測得菌液中根瘤菌的含量為3X 108cfu/mL。改良基礎鹽培養(yǎng)基(降解培養(yǎng)基，MM,g/L) =NaCl I. 00g, NH4NO3 I. 00g, K2HPO4
I.50g, KH2PO4 O. 50g,MgSO4. 7H20 0. 50g，加超純水至 1L，ρΗ7· 0 7· 5。添加 PCB77 (3，3’，4，4’-四氯聯(lián)苯)，使其濃度達到15mg/L，作為唯一碳源。(沈雨佳等，2007)甘露醇酵母汁瓊脂培養(yǎng)基(YMA) (g/L):甘露醇10. 0g，酵母粉O. 4g，K2HPO4 O. 5g，MgSO4O. 2g，NaCl O. 2g，微量元素溶液 lmL，加超純水至 lL，pH7. 0-7. 2，121°C滅菌 20min。微量元素溶液(g/L) =H3BO3 2. 86g, MnSO4 I. 81g, ZnSO4 O. 22g, CuSO4 0. 80g, H2MoO2 0. 02g。利用2mol/L HCl和2mol/L NaOH溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH值在7. 0_7. 2，為了避免水中氯離子對實驗過程的影響，培養(yǎng)基采用超純水配制。供試土壤米自南京市棲霞區(qū)農(nóng)田土壤，未檢出PCBs,pH值為6. 32±O. 21,風干后·過60目篩，向其中添加PCB77，使土壤中PCB77含量達到10mg/kg。主要化學品PCB77和 PCBs 混合標準樣品包括 PCB8，PCB18，PCB28，PCB44, PCB52,PCB66, PCB77, PCB101, PCB105, PCB118, PCB126, PCB128, PCB138, PCB153, PCB170, PCB180,PCB187, PCB195, PCB200, PCB206, PCB209共21種單體)購自北京百靈威化學技術(shù)有限公司。丙酮、正己烷等有機溶劑均為分析純，重蒸后使用。硫酸為優(yōu)級純，無水硫酸鈉(分析純)、硅膠(10(Γ200目，分析純)、中性氧化鋁(分析純)400°C活化6h，冷卻后置于全玻璃容器中密封貯存，待用。另備色譜純正己烷、酸性硅膠(硅膠濃硫酸=2 :1，質(zhì)量比)。2. I. 2菌株ZYl對模擬污染土壤中PCBs的降解試驗試驗設置2個處理試驗組(R):接種20%活菌液，對照組(CK):接種20%滅活菌液。每個處理3次重復。根瘤菌菌液濃度為3X108cfu/mL。稱取供試土壤200g (干重)裝入培養(yǎng)瓶，向其中添加PCB77的丙酮溶液，至終濃度為10mg/kg (干重)土。向土壤中接種根瘤菌菌懸液30mL，充分拌勻。將土壤含水量調(diào)整到田間持水量(Water-Holding Capacity，WHC)的45%，在28°C恒溫箱中培養(yǎng)，分別在第0、7、14、28d取樣分析測定土壤PCBs含量變化。2. I. 3 土壤中多氯聯(lián)苯組分含量的分析方法稱取冷凍干燥土壤樣品10. Og放入離心管，加入體積比I: I的丙酮和正己烷混合溶劑30mL，蝸旋混合儀振蕩數(shù)秒，靜置12h浸提。在水溫25°C，頻率為100%條件下超聲提取15min,離心(1500rpm/min,5min),上清液過濾,濾液收集至爺形瓶中。重復超聲提取2次。將三次離心液70mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(450mbar,60rpm/min,水浴鍋42°C)近干(800 μ L),加入5mL正己燒替換I次,濃縮至2mL后轉(zhuǎn)入復合娃膠柱進行純化。復合娃膠柱(長250mm,內(nèi)徑IOmm)內(nèi)依次裝填娃膠、中性氧化招、酸性娃膠和無水硫酸鈉(w/w=2:2:1:1)。用IOmL正己烷淋洗該柱，棄去淋洗液，然后加入處理后的樣品提取液，用25mL正己烷洗脫，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用正己烷定容至5mL，待上機分析。色譜條件采用帶有電子俘獲檢測器和自動進樣器的Varian 3800型氣相色譜儀分析。色譜柱CP-sil24CB (30mX0. 25_X0. 25um)，進樣溫度為260°C，檢測器溫度為300°C。程序升溫初始溫度為180°C，保留O. 5min, 30°C /min梯度升溫至260°C，持續(xù)18min,然后15°C /min梯度升溫至270°C,持續(xù)2min。無分流進樣IyL,載氣為高純氮,流速為 I. OmT,/miη。
質(zhì)量控制采用七點校正進行標準物質(zhì)的校正曲線和外標法進行，借助StarworkStation6. O進行數(shù)據(jù)采集和處理。21種PCB混標(10 μ g/kg)的基質(zhì)加標平均回收率是72. 0 109· 8%，相對標準偏差是3. 1% 57. 3%，儀器檢測限為I. 43 5. 10 μ g/kg,方法檢出限為I. 33^3. 45 μ g/kg。該方法滿足痕量有機物定量分析要求。2. I. 4 土壤中聯(lián)苯降解菌數(shù)量的測定米用最大或然數(shù)法(Most Probable Number, MPN)測定不同培養(yǎng)時期土壤中聯(lián)苯降解菌數(shù)量(Wrenn和Venosa，1996)。稱取5. OOg鮮土置于盛有IOmL無菌水的玻璃離心瓶中，充分震蕩，使土壤分散，即得到KT1 土壤懸浮液。在無菌條件下，吸取ImL土壤懸浮液至9mL無菌水中得到10_2 土壤懸浮液，依次稀釋至10_6。在96孔板微孔中分別加入10 μ L
0.4g/mLK*、72yL Bushnell Haas (BH無機鹽培養(yǎng)基)和10 μ L不同稀釋梯度的土壤懸浮液。用錫箔紙包裹避光后，于28°C培養(yǎng)兩周，向每個微孔添加3g/L無菌碘硝基四唑紫(p-iodonitrotetrazolium violet)培養(yǎng)12h,根據(jù)微孔顏色變化情況查MPN表計算土壤中 聯(lián)苯降解菌數(shù)量。2. 2結(jié)果與討論2. 2. I污染土壤中PCBs總量的變化經(jīng)過28d的ZYl生物強化修復后，各處理中污染土壤PCBs的總殘留量變化動態(tài)見圖7。與接滅活菌液的對照組相比，接種活菌ZYl顯著促進了污染土壤中PCBs總量的降低，在第 0、4、7、14、28d，土壤中 PCBs 殘留量分別為 9409. 22 μ g/kg、8151. 84 μ g/kg、4348. 65 μ g/kg、3945. 53 μ g/kg 和 3550. 78 μ g/kg，在第 28d 降解率達到了 57. 6%。從降解動態(tài)上來看，各處理土壤中PCBs的總殘留量均隨修復時間的延長而逐漸降低。2. 2. 2 土壤中各PCBs組分含量的變化修復后土壤中PCBs各組分的組成變化見圖8，研究表明，PCBs生物可降解程度與其氯原子取代數(shù)量有關(guān)，隨著氯原子取代數(shù)量的增加，生物可降解性逐漸降低。由圖8可知，四氯組分百分比隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而逐漸降低，在第0、4、7、14、28d時，分別為100%、85. 1%、45. 0%、42. 6%和40. 9%，下降速率表現(xiàn)為先快后慢，在第4 7(1之間下降最快；三氯組分百分比從第4天至第28天由6. 6%逐漸上升到44. 4% ;值得注意的是，二氯組分在第0、4、7、14、28天百分含量分別為8. 4%,36. 7%,22. 1%和14. 7%，表現(xiàn)出先增加再減少的趨勢。在第(Γ4天，微生物主要利用四氯聯(lián)苯PCB77為能源生長，并將其分解轉(zhuǎn)化成二氯聯(lián)苯和三氯聯(lián)苯，但由于這一時期微生物數(shù)量有限，故二氯、三氯聯(lián)苯百分比緩緩上升；在Γ7天，微生物數(shù)量對數(shù)增長，四氯聯(lián)苯持續(xù)被分解利用，但這階段仍以脫氯作用為主，二氯、三氯聯(lián)苯快速累積；微生物具有優(yōu)先選擇利用低氯代聯(lián)苯的特性，當土壤中二氯和三氯聯(lián)苯累積到一定量時，它們開環(huán)反應已經(jīng)超過四氯聯(lián)苯的脫氯作用，因此四氯聯(lián)苯百分含量趨于平穩(wěn)，而二氯聯(lián)苯結(jié)構(gòu)被微生物開環(huán)破壞，百分含量迅速降低。2. 2. 3 土壤中聯(lián)苯降解菌數(shù)量的動態(tài)各處理土壤中聯(lián)苯降解菌數(shù)量見圖9。研究結(jié)果顯示，接種第0、7、14d試驗組(R)土壤中聯(lián)苯降解菌數(shù)量分別為6. 4父105]\0^/^干土、4.0\106]\0^/^干土、4. 7X106MPN/g干土，是對照處理(CK)中聯(lián)苯降解菌數(shù)量的7. f 8. 9倍，接種活的根瘤菌的處理顯著提高了土壤中聯(lián)苯降解菌總量。2. 2. 4 土壤PCBs遺傳毒性當量的變化
采用毒性當量因子(Toxic equivalency factor, TEF)計算出土壤PCBs遺傳毒性當量(TEQ)的結(jié)果如圖10所示。從圖中可以看出，接菌處理1 在第0、4、7、14和28(1毒性當量分別為O. 94,0. 82,0. 43,0. 39和O. 36，相對于對照組接菌處理顯著降低了土壤中PCBs 遺傳毒性當量(P < O. 05)，這說明菌株ZYl對PCBs污染土壤具有良好的修復潛力，可降低PCBs污染土壤對生態(tài)環(huán)境和人體健康的風險。
權(quán)利要求
1.中慢生根瘤菌(ifesorAizoAiw sp. strain ZYl),該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年9月25日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 6622。
2.權(quán)利要求I所述的中慢生根瘤菌(ifesorAizoAia sp. strain ZYl)的培養(yǎng)基，其特征在于按質(zhì)量比例組成為NaCl I. 00g, NH4NO3 I. 00g, K2HPO4 I. 50g, KH2PO4 O. 50g,MgSO4. 7H20 0. 50g，微量元素溶液I. 0 mL，多氯聯(lián)苯為15 mg，該培養(yǎng)基pH 7. 0-7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中慢生根瘤菌(ifesorAizoAiw sp. strain ZYl)的培養(yǎng)基，其特征在于所述多氯聯(lián)苯為PCB77。
4.權(quán)利要求I所述的中慢生根瘤菌(ifesorAizoAiw sp. strain ZYl)在多氯聯(lián)苯污染土壤修復中的應用。
全文摘要
中慢生根瘤菌ZY1及其在土壤修復中的應用，該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年9月25日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.6622。該菌能在以多氯聯(lián)苯為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)10d時其降解率達到62.7%，而接種于土壤28d后，土壤中PCBs降解率達到57.6%，該菌株在PCBs污染土壤的生物修復中具有很好的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK102876621SQ201210417029
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者滕應, 李秀芬, 駱永明, 李振高 申請人:中國科學院南京土壤研究所