一種1,5-脫水葡糖醇的脫氫酶法測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種1，5-脫水葡糖醇的脫氫酶法測定方法，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。其特點是：用ATP依賴性己糖激酶(ATP-HK)將待測物1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)和主要干擾物葡萄糖(Glu)分別轉(zhuǎn)化為1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸(1，5-AG-6-P)和葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)，通過系統(tǒng)中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)，建立ATP再生系統(tǒng)，確保1，5-AG和Glu分別向1，5-AG-6-P和Glu-6-P轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的1，5-AG-6-P被1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶(AG6PDH)特異性地脫氫氧化，同時使2-(4-碘苯)-5-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑(WST-5)還原為有色物質(zhì)，用全自動生化分析儀比色定量。
【專利說明】一種1 ’ 5-脫水葡糖醇的脫氫酶法測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及1，5_脫水葡糖醇(1，5-AG)的脫氫酶法測定方法，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]血清中1，5_脫水葡糖醇濃度不受即時的飲食、葡萄糖攝食量影響，能快速、靈敏的反映3-5天內(nèi)總血糖變化情況。糖尿病患者血清1，5-AG顯著降低，當(dāng)糖尿病得到良好控制時，血清1，5-AG的日回升率十分穩(wěn)定，不受冶療方法、性別、年齡、體重、患病時間和血清中1，5-AG起初的濃度影響，回升幅度和對糖尿病診斷的敏感性及特異性均明顯大于常用的糖尿病診斷指標(biāo)糖化血紅蛋白(HbAlc)和果糖胺(GSP)。
[0003]文獻報道測定1，5_AG的方法有陰離子交換層析法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS)、全自動酶分析法等，前三種方法需要對1，5-AG進行衍生和復(fù)雜的樣品前處理，同時需特殊、昂貴儀器，不適合臨床常規(guī)分析。全自動酶法雖好，但易受血清中高濃度葡萄糖干擾，如Fukumura Y (Clin Chem, 1994,40:2013-2016.)、陳國軍等(中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1999，22 (6):358-361.)在測定1，5-AG時，將葡萄糖通過葡萄糖激酶(GK)轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，然后用吡喃糖氧化酶(PROD)將1，5-AG氧化產(chǎn)生過氧化氫并偶聯(lián)TrindreJ s反應(yīng)顯色定量。由于PROD酶的底物特異性不佳，反應(yīng)中生成的6-磷酸葡萄糖在丙酮酸激酶等含量不足時 易重新轉(zhuǎn)化為葡萄糖，生成的葡萄糖被PROD酶氧化后參與Trindre^ s反應(yīng)并顯色，從而引起1，5_AG的測定結(jié)果假性升高。
[0004]本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)的不足，通過ATP依賴性己糖激酶(ATP-HK)將待測物1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)和主要干擾物葡萄糖(Glu)分別轉(zhuǎn)化為1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸(l，5-AG-6-P)和葡萄糖-6磷酸(Glu_6_P)，并通過系統(tǒng)中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)，建立ATP再生系統(tǒng)，確保1，5-AG和Glu分別向1，5-AG-6-P和Glu-6-P轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的1，5-AG-6-P用1，5-脫水葡萄糖醇_6_磷酸脫氫酶(AG6H)H)特異性地脫氫氧化，利用2-(4-碘苯)-5-(2，4_ 二硝基苯)-5-(2，4_ 二磺基苯)_2H_四氮唑(WST-5)的變色反應(yīng)實現(xiàn)對I，5-AG的定量檢測。該法避免使用了價格昂貴的葡萄糖激酶和批喃糖氧化酶，方法特異性好，高達14.8g/L(82.2mmol/L)的葡萄糖不干擾本法測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了 1，5_脫水葡糖醇(1，5-AG)的脫氫酶法測定方法，用于血清1，5_脫水葡糖醇的測定。該測定體系主要是用ATP依賴性己糖激酶(ATP-HK)將待測物1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)和主要干擾物葡萄糖(Glu)分別轉(zhuǎn)化為1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸(L5-AG-6-P)和葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)，通過系統(tǒng)中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)，建立ATP再生系統(tǒng)，確保1，5-AG和Glu分別向1，5-AG-6-P和Glu_6_P轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的1，5-AG-6-P被1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶(AG6H)H)特異性地脫氫氧化，同時使2-(4-碘苯)-5-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑(WST-5)還原為有色物質(zhì)，用全自動生化分析儀比色定量。
[0006]為了達到理想的檢測效果，本發(fā)明還特別提供了 1，5_脫水葡糖醇(1，5-AG)的脫氫酶法測定試劑，分為A、B 二個組份。兩個組份的具體成份組成可表述如下。
[0007]A 組份:
[0008]
【權(quán)利要求】
1.一種1，5-脫水葡糖醇的脫氫酶法測定方法，其特征是用ATP依賴性已糖激酶(ATP-HK)將待測物1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)和主要干擾物葡萄糖(Glu)分別轉(zhuǎn)化為1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸(l，5-AG-6-P)和葡萄糖_6磷酸(Glu_6_P)，通過系統(tǒng)中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)，建立ATP再生系統(tǒng)，確保1，5-AG和Glu分別向I，5-AG-6-P和Glu-6-P轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的I，5-AG-6-P被I，5-脫水葡萄糖醇_6_磷酸脫氫酶(AG6H)H)特異性地脫氫氧化，同時使2- (4-碘苯)-5- (2,4- 二硝基苯)_5_ (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑(WST-5)還原為有色物質(zhì)，用全自動生化分析儀比色定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種1，5-脫水葡糖醇的脫氫酶法測定方法，其特征是在將主要干擾物葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)的同時，必須建立ATP再生系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種1，5_脫水葡糖醇的脫氫酶法測定方法，其特征是在將主要干擾物葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)的酶是ATP依賴性己糖激酶(ATP-HK)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種1，5_脫水葡糖醇的脫氫酶法測定方法，其特征是待測物1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)在轉(zhuǎn)化為1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸(1，5-AG-6_P)后，被1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸`脫氫酶(AG6H)H)特異性地脫氫氧化。
【文檔編號】C12Q1/26GK103725748SQ201210417853
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月16日
【發(fā)明者】潘利琴 申請人:溫州市人民醫(yī)院