專利名稱：青霉菌、固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶及其制柚皮高酯果膠的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶學(xué)(C12P)技術(shù)，具體涉及一株青霉菌、其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，及該纖維素酶用于制柚皮高酯果膠的方法。
背景技術(shù)：
果膠(Pectin)是一種親水性植物膠，廣泛存在于高等植物的根、莖、葉、果的細(xì)胞壁中。果膠主要成分是D-半乳糖醒酸(D-galactuonic acid),其中部分半乳糖醒酸被甲酯化，分子量約在3 18萬之間。商品化果膠有液體果膠和果膠粉，果膠的色澤從乳白色到淡黃褐色，因原料、生產(chǎn)工藝而不同。根據(jù)酯化度(DM)不同，果膠分為高甲氧基果膠(酯化度大于50%，相當(dāng)于甲氧基含量大于7%)和低甲氧基果膠(酯化度小于50%，相當(dāng)于甲氧基含量小于7%)，后者包括酰胺果膠。果膠具有良好的乳化、增稠、穩(wěn)定和膠凝作用，在食品、紡織、印染、煙草、冶金等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。由于果膠具有抗菌、止血、消腫、解毒、止瀉、降血脂、抗輻射等作用，還是一種優(yōu)良的藥物制劑基質(zhì)，可用來制造輕瀉劑、止血劑、毒性金屬解毒劑、血漿代用品等，是醫(yī)藥和化妝品工業(yè)不可缺少的輔料。果膠是人體七大營養(yǎng)素中水溶性膳食纖維的主要成分，隨著功能性多糖的開發(fā)研究，果膠作為水溶性膳食纖維，越來越受到研究與加工行業(yè)的重視，具有良好的抗腹瀉、抗癌、治療糖尿病和減肥等多種作用。柚為蕓香科柑桔屬植物常綠果樹的成熟果實(shí)，在我國南方許多地區(qū)大量種植。我國柚皮資源豐富，但大部分被丟棄，且造成了環(huán)境污染。柚皮中果膠含量較高，且所含果膠膠凝度高、級別高。因此，從柚皮中提取果膠具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。從柚皮中提取果膠目前已有商品化生產(chǎn)，也有許多文獻(xiàn)報(bào)道，如周盡花報(bào)道了通過正交試驗(yàn)法得到的酸法提取柚皮果膠的工藝條件，果膠得率為14.9%(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18:483-486)， 又如趙梅等報(bào)道了采用酸解法提取柚皮低甲氧基果膠的工藝條件，果膠得率為5.51% (食品與藥品，2008，10 (7):29_31)。雖然酸提取法仍是目前最常用的果膠提取方法，但酸提取容易造成環(huán)境污染。因此人們積極探討減少環(huán)境污染的其他提取方法。如離子交換法(孫潤，食品工業(yè)科技，1989, (2):40-41 )、微波提取法(Dredycfuss M S，Appl Eneerio Nicobio, 1980, 38 (1):13;M Kratchanova, Carbohydrate Polymers, 2004, 56: 181 185 ;孔湊，鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào)，2000, 21 (2):11-15)，這些方法都難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。最常用的果膠的分離方法是乙醇沉淀法。其他分離方法也有報(bào)道，如鹽析法(鄧紅，食品科學(xué)，2002,23 ( 3 ):57-60 ;張玲華，農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā)，2000，(11):12 14)。乙醇沉淀法生產(chǎn)的果膠色澤淺、灰分含量少、膠凝度高、品質(zhì)好。雖然乙醇使用量較大，但若對廢乙醇進(jìn)行回收和循環(huán)利用，則可降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是采用酶法提取柚皮果膠，以減輕酸法提取所造成的環(huán)境污染，同時(shí)提取率與酸法接近甚至超過酸法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株青霉菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶及用于制備柚皮高酯果膠的新方法。其主要特點(diǎn)為用一株青霉菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，萃取固態(tài)培養(yǎng)物中的纖維素酶，經(jīng)冷凍干燥制得纖維素酶粉。用制得的纖維素酶粉提取柚皮果膠，用乙醇沉淀法沉淀酶提取液的果膠，離心后將沉淀干燥制得果膠成品，經(jīng)測定其甲氧基含量屬于高酯果膠。該發(fā)明提供的柚皮高酯果膠制備方法，其果膠粉的果膠提取率高于目前報(bào)道的酸提取法，且減輕酸對環(huán)境的污染。本發(fā)明提供一株青霉菌,該菌株為青霉菌sp.) WZUX01,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6370。本發(fā)明還提供上述的青霉菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法，包括如下步驟:
1)所述菌株青霉菌WZUXOl劃線轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，25 35°C下培養(yǎng)3 6天；
2)以水洗脫步驟I)得到的培養(yǎng)物中的青霉菌，得到孢子懸液，接入滅菌的稻草麩皮培養(yǎng)基，25 35°C下培養(yǎng)5 7天，其中稻草麩皮培養(yǎng)基由如下重量比的成分構(gòu)成:稻草粉:麩皮:(NH4)2SO4:水=4 36:8 48:0 16:24 80 ；
3)步驟2)得到的固態(tài)培養(yǎng)物加入蒸餾水搗碎，35 45°C恒溫浸提2 10h，過濾，得酶液，經(jīng)冷凍干燥即得纖維素酶。優(yōu)選地，上述恒溫浸提2 10h后，置于4°C下浸泡24 h。優(yōu)選地，上述步驟2)中所述孢子懸液的孢子量為I X IO12IX IO12個(gè)/mL，所述孢子懸液的接種量:孢子懸液和稻草麩皮培養(yǎng)基的體積重量比為I mL:Γ3 g，優(yōu)選為1:2。優(yōu)選地，步驟2)所述稻草麩皮培養(yǎng)基由如下重量比的成分構(gòu)成:稻草粉:麩皮:(NH4)2SO4:水=8:32:8:52。`上述的青霉菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法得到的纖維素酶。本發(fā)明還提供上述的纖維素酶用于制備柚皮高酯果膠的方法，包括如下步驟:
1)將柚皮烘干、粉碎，得柚皮粉；
2)將柚皮粉加入酶反應(yīng)器內(nèi)，加入緩沖液，再加入所述纖維素酶進(jìn)行提取，然后離心得果膠液；
3)調(diào)節(jié)步驟2)所得果膠液的pH為5 9，加入乙醇，沉淀，離心得沉淀物，干燥，得果膠。沉淀時(shí)間優(yōu)選為2 32h。優(yōu)選地，步驟2)中所述緩沖液的pH值為5 7，柚皮粉和所述緩沖液的重量體積比為5 20 g: 100 mL，所述緩沖液更優(yōu)選為pH值為7的HAC/NaAC緩沖液。優(yōu)選地，步驟2)中所述纖維素酶的加入重量為所述柚皮粉重量的1°/Γ3%。優(yōu)選地，步驟2)中提取的條件為:在35 45°C下提取24 48 h。優(yōu)選地，步驟3)中調(diào)節(jié)步驟2)所得果膠液的pH為5 9，加入乙醇至其在果膠液中的體積百分比濃度為6(Γ80%。本發(fā)明能夠達(dá)到如下效果 廣霉鎮(zhèn)QPen i c i 11 i Utn sp.)WZUX01固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的能力為每克固態(tài)培養(yǎng)物產(chǎn)CMC酶活力為8210.667U，所制得的纖維素酶粉的CMC酶活力為300U/mg ;纖維素酶粉提取柚皮果膠的柚皮粉果膠提取率為19.30%,乙醇沉淀果膠的果膠沉淀率為80.23%，柚皮粉的果膠成品提取率為15.48%，所得果膠成品的甲氧基含量可達(dá)30.48%，屬于高酯果膠。


圖1是梟霉^QPeniciIIium sp.) WZUXOl固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶曲線。圖2是溫度對纖維素酶粉CMC酶活力影響曲線。圖3是pH對纖維素酶粉CMC酶活力影響曲線。菌株保藏
本發(fā)明的青霉sp.)WZUX01，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6370，保藏日期為2012年7月20日。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。實(shí)施例一 廣霉霞iPenicillium sp.) WZUXOl固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 菌株
著纖QPenicillium sp.)WZUX01，由溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院自溫州茶山稻桿堆肥土壤中分離獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC N0.6370。(2)培養(yǎng)基
土豆培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):土豆汁IOOOmL,瓊脂20g，pH自然。土豆汁的制備:取200g新鮮去皮土豆，切成小塊，加IOOOmL蒸餾水煮Ih后，以紗布過濾，用蒸餾水補(bǔ)至1000mL。稻草麩皮培養(yǎng)基各組分的重量比為:稻草粉:麩皮:(NH4)2SO4:水=4 36:8 48:0 16:24 80，pH 自然。(3)方法
保藏菌株青霉菌WZUX01劃線轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)4天，將IOmL的無菌水分多次加入已長滿霉菌的試管中，振蕩制得孢子懸液，測定孢子懸液的孢子數(shù)量，將孢子懸液接入已滅菌的稻草麩皮培養(yǎng)基，攪拌均勻，在25-35°C下培養(yǎng)4天，每天攪拌培養(yǎng)基I至2次。稱取得到的固態(tài)培養(yǎng)物10g，加入90mL的蒸餾水搗碎，40°C、150r/min恒溫水浴中振蕩浸提4h，置于冰箱中(4°C)浸泡24 h，紗布過濾得粗酶液，4000rpm下離心15分種，得上清液(酶液)，測定CMC酶活力。CMC酶活力測定方法:吸取適當(dāng)稀釋后的酶液0.5mL于試管中，加入含0.5%CMC_Na的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.05mol.L—1，pH4.4) 1.5 mL，然后在50°C水浴中反應(yīng)30 min后,立即在每試管內(nèi)加1.5mLDNS試劑,再在沸水中煮5 min后,立即用冷水冷卻，定容至25mL,在520nm處測定OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其還原糖含量。CMC酶活力單位定義為每分鐘內(nèi)水解纖維素生成I μ g還原糖量的酶量。以100°C水浴中滅活I(lǐng)Omin的酶液為空白對照(吳海龍等，科技通報(bào)，2008，24 (6):769 776)。孢子懸液的孢子數(shù)量采用血球計(jì)數(shù)板法測定。稻草麩皮培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的設(shè)定及結(jié)果見下表I。各實(shí)驗(yàn)組稻草麩皮培養(yǎng)基總量均為20g，孢子懸液的數(shù)量為I X IO12 9 X 1012/mL。表I稻草麩皮培養(yǎng)基配方 和培養(yǎng)條件的設(shè)定及結(jié)果
賣驗(yàn)組丨稻草:麩皮=(NH4)aSO4:水(W:W:W:W)I溫度CC )|CMC酶活力(U/g)
權(quán)利要求
1.株青霉菌，其特征在于，該菌株為青霉菌(/^wici77iw sp.)WZUX01,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6370。
2.權(quán)利要求1所述的青霉菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)所述菌株青霉菌WZUXOl劃線轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，25 35°C下培養(yǎng)3 6天； 2)以水洗脫步驟I)得到的培養(yǎng)物中的青霉菌，得到孢子懸液，接入滅菌的稻草麩皮培養(yǎng)基，25 35°C下培養(yǎng)5 7天，其中稻草麩皮培養(yǎng)基由如下重量比的成分構(gòu)成:稻草粉:麩皮:(NH4)2SO4:水=4 36:8 48:0 16:24 80 ； 3)步驟2)得到的固態(tài)培養(yǎng)物加入蒸餾水搗碎，35^450C恒溫浸提2 10h，過濾得酶液，經(jīng)冷凍干燥得纖維素酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述孢子懸液的孢子量為IX ΙΟ12、X IO12個(gè)/mL，所述孢子懸液的接種量:孢子懸液和稻草麩皮培養(yǎng)基的體積重量比為 ImL:1 3g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述稻草麩皮培養(yǎng)基由如下重量比的成分構(gòu)成:稻草粉:麩皮:(NH4) 2S04:水=8:32:8:52。
5.權(quán)利要求2 4任一項(xiàng)所述的青霉菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法得到的纖維素酶。
6.權(quán)利要求5所述的纖維素酶用于制備柚皮高酯果膠的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將柚皮烘干、粉碎，得柚皮粉； 2)將柚皮粉加入酶反應(yīng)器內(nèi)，加入緩沖液，再加入所述纖維素酶進(jìn)行提取，然后離心得果膠液； 3)調(diào)節(jié)步驟2)所得果膠液的pH為5 9，加入乙醇，沉淀，離心，沉淀物干燥，得果膠。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述緩沖液的pH值為5 7，柚皮粉和所述緩沖液的重量體積比為5 20g: 100mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述纖維素酶的加入重量為所述柚皮粉重量的1°/Γ3%。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中提取的條件為:在35 45°C下提取24 48 h0
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)中調(diào)節(jié)步驟2)所得果膠液的pH為5 9，加入乙醇至其在果膠液中的體積百分比濃度為6(Γ80%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株青霉菌、固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶及其制柚皮高酯果膠的方法。該青霉菌菌株為青霉菌(Penicillium sp.)WZUX01，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.6370。該青霉菌(Penicillium sp.)WZUX01固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，該纖維素酶可用于制備柚皮高酯果膠，以此方法制得的柚皮果膠中甲氧基含量可達(dá)30.48%。
文檔編號C12R1/80GK103087922SQ20121042018
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者周茂洪, 趙肖為 申請人:溫州大學(xué)