專利名稱：肝素酶Ⅲ的固定化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種肝素酶III的固定化方法，尤其涉及一種以殼聚糖為固定化材料對肝素酶III進行固定化的方法，實現(xiàn)肝素酶III的固定化和可重復利用性。
背景技術：
肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離出來的，其后又發(fā)現(xiàn)在一些微生物和動物組織中也有肝素酶存在。目前有學術論文報道的肝素酶大約有10多種，得到較為細致研究的只有來自肝素黃桿菌的3種酶，分別是肝素酶I (EC編號4. 2. 2. 7)、肝素酶II (無EC編號)、肝素酶IIKEC編號
4.2. 2. 8)。肝素酶I、II、111分別是分子量大約43、78、66kd的單體蛋白質(zhì)，其等電點均在9. O左右，應用和研究非常廣泛。 肝素酶III是一種主要以硫酸乙酰肝素為催化降解底物的酶，只對肝素鏈上極少的特定位點具有催化裂解作用。肝素酶III對制備硫酸乙酰寡糖、研究肝素和硫酸乙酰肝素的結(jié)構(gòu)有重要的作用。然而游離的肝素酶III在發(fā)生反應時需要將其加入底物中，反應以后酶溶液、底物和產(chǎn)物混合在一起不容易分離，導致酶無法重復使用，利用效率低下，這為應用帶來很多不便，需要尋找一種能提高肝素酶III利用效率的方法。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，具有分離回收容易、可多次重復使用、操作連續(xù)可控等一系列優(yōu)點，因此，對肝素酶III的固定化是一種提高使用效果的理想選擇。但目前對肝素酶III進行固定化的研究未見報道。經(jīng)過長期研究，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種高效并且低成本的肝素酶III的固定化方法。籍此，本發(fā)明給出了一種以殼聚糖微球為材料對肝素酶III固定化的方法，成功實現(xiàn)了肝素酶III與底物和產(chǎn)物的分離，使酶的應用潛力更大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用殼聚糖微球固定肝素酶III的方法，包括下述步驟
(1)肝素酶III溶液的制備選擇TriS-HCl緩沖液(pH7.0，其中含CaCl2)作為肝素酶III的溶劑，將肝素酶III溶解在該緩沖液中，制得肝素酶III溶液；
(2)肝素酶III與殼聚糖微球的交聯(lián)將殼聚糖微球用Tris-HCl緩沖液(pH7. 0，其中含IOmM CaCl2)充分溶脹，再取步驟(I)獲得的肝素酶III溶液，將其加入該殼聚糖微球中，進行交聯(lián)；
(3)用乙酸-乙酸鈉和Tris-HCl兩種緩沖液分別洗滌上述交聯(lián)后的殼聚糖微球至洗脫液無酶活性；
(4)利用還原劑對步驟(3)中獲得的固定了肝素酶III的殼聚糖微球進行處理，隨后，如果需要，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶III。在上述實施方案中，優(yōu)選步驟(I)中用于溶解肝素酶III的溶劑TriS-HCl的濃度為 10-50mM，其中含 CaCl2 濃度為 lO-lOOmM，最優(yōu)選 50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含 IOmMCaCl2)；
在上述實施方案中，優(yōu)選步驟(I)中肝素酶III在溶液中的濃度為O. l-100IU/ml，更優(yōu)選為 1-10 IU/ml，最優(yōu)選為 2-5 IU/ml。在上述實施方案中，步驟(2)中所述殼聚糖微球可以通過現(xiàn)有技術中已知的制備方法進行制備，例如，可以采用反相懸浮法進行制備，其中使用的交聯(lián)劑可以由本領域技術人員適當選擇，例如應用最為廣泛的交聯(lián)劑為戊二醛。所述溶脹時間可以根據(jù)溶脹程度由本領域技術人員進行控制，例如，溶脹20分鐘。在上述實施方案中，優(yōu)選步驟(2)中使用的殼聚糖微球與肝素酶III溶液的體積比為 1/10-10/1，更優(yōu)選 1/5-5/1，最優(yōu)選 1/2-2/10在上述實施方案中，優(yōu)選在步驟(2)中，交聯(lián)溫度為4-10°C，交聯(lián)時間為8-24h，更優(yōu)選的交聯(lián)溫度為8-10°C，交聯(lián)時間為12-20h。 在上述實施方案中，優(yōu)選步驟(3)中使用的緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH
6.0-8. 0)，更優(yōu)選為50-150mM乙酸-乙酸鈉(pH 6. 5-8. 0，其中含50_200mM NaCl)緩沖液，最優(yōu)選為IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，其中含IOOmM NaCl)緩沖液。在上述實施方案中，優(yōu)選步驟(3)中使用的緩沖液為Tris-HCl緩沖液，更優(yōu)選為50mM Tris-HCl (pH 6. 5-8. 0，其中含 IO-IOOmM CaCl2 和 50_200mM NaCl)緩沖液，最優(yōu)選為 50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含 50mM CaCl2 和 IOOmM NaCl)緩沖液。在上述實施方案中，在步驟(4)的還原劑處理步驟中，是對殼聚糖上的氨基與戊二醛上的醛基共價交聯(lián)后產(chǎn)生的不穩(wěn)定C=N雙鍵進行還原，該還原步驟中可以使用任何已知的可以用于還原該雙鍵的還原劑，比如硼氫化物、氫化鋁鋰、雷尼鎳等，優(yōu)選硼氫化物，比如堿金屬硼氫化物，例如硼氫化鈉、硼氫化鉀等。在上述實施方案中，優(yōu)選步驟(4)中使用的NaBH4濃度為l-10mg/ml，反應
0.5-10h ;最優(yōu)選擇濃度為l_5mg/ml的NaBH4,反應l_3h。在上述實施方案中，優(yōu)選步驟(4)中使用Tris-HCl緩沖液沖洗除去剩余的還原劑，更優(yōu)選該緩沖液為50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)0在上述實施方案中，在進行步驟(4 )之后，為了能夠?qū)υ摲椒ㄟM行評價，獲得固定化酶活與上樣的游離酶活相比能夠得出整個固定化過程的效率，以及對固定化酶進行定量，可以在進行還原劑處理步驟之后，測固定化酶活。在上述實施方案中，在獲得固定化的肝素酶III之后，保存條件為保存在Tris-HCl緩沖體系中，pH 6. 5-8. 0，添加金屬鹽CaCl2和NaCl，保存溫度為0_25°C，最優(yōu)條件為保存在50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含IOmM CaCl2),溫度為4_10°C環(huán)境中。在使用時，該固定在載體上的酶可以和底物直接反應，反應完后經(jīng)分離，固定在載體上的酶可以再次使用。固定化肝素酶可以應用于血液中肝素的清除，用于低分子肝素的生產(chǎn)制備，用于肝素和低分子肝素樣品的部分或完全降解。在上述實施方案中，優(yōu)選步驟(2)中的反相懸浮法為
取市售殼聚糖粉末溶于乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將分散劑加入油相中，然后將酸性殼聚糖溶膠加入油相中，乳化之后，加入戊二醛進行交聯(lián)，交聯(lián)完畢后加入等體積的NaOH和無水乙醇的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復洗滌，即得殼聚糖微球。在上述實施方案中，用于溶解殼聚糖的溶劑為2%的乙酸溶液，殼聚糖的質(zhì)量分數(shù)為2%。優(yōu)選分散劑為Span 80，優(yōu)選油相為液體石蠟，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為500-800rpm ;優(yōu)選的交聯(lián)劑為25%的戊二醛，優(yōu)選的交聯(lián)時間為l_2h，優(yōu)選的2. 5M NaOH與無水乙醇的體積比為.1/1。在上述實施方案中，優(yōu)選使用的固定化肝素酶III測定方法為DMB法[Richard,ff. et al. , (1986), Biochimica et Biophysica Acta, 883, 173-177]和 232nm 法[Bernstein, H. , (1987), AppI. Biochem. Biotech. 16, 129-143]。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肝素酶III的固定化方法包括下述步驟
(la)、殼聚糖微球的制備
取殼聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將Span 80加入液體石蠟中，高速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入戊二醛作為交聯(lián)劑，交聯(lián)溫度為40°C，交聯(lián)完畢后加入2. 5M NaOH和無水乙醇(體積比1/1)的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復洗滌，即得殼聚糖微球；
(1)配制緩沖液50mMTris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2),將其作為肝素酶III的溶齊U，制得肝素酶III溶液，調(diào)整濃度至酶活力2-5IU/ml ；
(2)取步驟(I)獲得的肝素酶III溶液，將其加入用50mMTris-HCKpH 7.0，其中含IOmMCaCl2)充分溶脹過的步驟(Ia)獲得的殼聚糖微球中，殼聚糖與肝素酶的體積比為1/2-2/1，.4-10°C交聯(lián) 12-20h ；
(3)配制IOOmM 乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，其中含 IOOmM NaCl)和 50mM Tris-HCl (pH.7.5，其中含50mM CaCljP IOOmM NaCl)緩沖液，先后對交聯(lián)后的殼聚糖微球進行洗滌，緩沖液IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，其中含IOOmM NaCl)洗脫體積為殼聚糖微球體積的兩倍，然后用緩沖液50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含50mM CaCl2和IOOmM NaCl)洗滌，收集洗脫液測酶活，直至洗脫液中無游離酶；
(4)在固定化酶中加入還原劑，反應后除去殘余還原劑在固定了肝素酶III的殼聚糖微球中加入NaBH4l-5mg/ml，反應l-3h進行還原，反應完畢后，以50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)為緩沖液，對殼聚糖微球進行洗滌，所用緩沖液體積是殼聚糖微球體積的.3-5 倍。本發(fā)明的有益效果
通過以上所述的發(fā)明內(nèi)容，本發(fā)明實現(xiàn)了肝素酶III的固定化和可重復利用。該方法可對肝素酶III達到顯著的固定化效果，每毫升的殼聚糖微球可以固定化3. 11 IU的肝素酶III，交聯(lián)效率可達到80. 3%，在特定的保存條件中可以使固定化的肝素酶III在保存I周后仍保持93. 5%的活性。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例
所用肝素酶為從肝素黃桿菌發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體中分離純化得到的，酶制備過程見發(fā)明專利申請?zhí)?00910039360. I “一種肝素黃桿菌肝素酶III的制備方法”中的實施例。
a、取Ig市售的純度為99%的殼聚糖粉末溶于50ml 2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將0.6g市售化學純的Span 80 (國藥集團化學試劑有限公司，化學純)加入IOOml液體石蠟中，以SOOrpm的轉(zhuǎn)速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入5ml質(zhì)量分數(shù)為25%的戊二醛作為交聯(lián)劑，交聯(lián)溫度為40°C，Ih后加入IOOml的等體積的2. 5M NaOH和無水乙醇的混合液,攪拌后IOmin后靜置,棄去油層和水層,用超純水沖洗5次，棄去水層即得殼聚糖微球。b、選擇50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)緩沖液作為肝素酶III的溶齊U，制得用DMB法測得酶活為31. 20 U/ml，用232nm法測定酶活為3. 88 IU/ml的肝素酶III溶液，取Iml該肝素酶液加入裝有Iml殼聚糖微球的小柱中，搖勻，10°C冷庫中交聯(lián)15h，棄去交聯(lián)后的上清液。C、用2ml的IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，其中含IOOmM NaCl)緩沖液洗滌上述交聯(lián)肝素酶后的殼聚糖微球，再用約IOml的50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含50mM CaCl2和IOOmM NaCl)緩沖液洗滌上述交聯(lián)后的殼聚糖微球，至洗脫液檢測無酶活為止。
d、在上述固定了肝素酶III的殼聚糖微球中加入Iml的lmg/ml的硼氫化物陰離子的堿金屬鹽NaBH4，反應lh，用IOml的50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)緩沖液洗滌，以除去殘余的NaBH4，得到固定化酶1ml。用DMB法測得固定化酶活性為23. 19 U/ml，換算為肝素酶國際酶活單位(即232nm法測定的酶活值)為3. 11 IU/ml。肝素酶III的固定化效率為80. 3%，每Iml殼聚糖微球可固定3. 11 IU/ml的肝素酶III。e、將上述固定化酶置于2ml的50mM Tris-HCl (pH 7.5，其中含50mM CaCl2和IOOmM NaCl)，溫度為4_10°C的環(huán)境中保存。在保存I周后固定化酶的活力經(jīng)測定為保存前的 93. 5%ο在實施例中，測定酶活力的具體方法如下
I) 232nm法測酶活在5ml石英比色皿中加入在30°C預熱過的2. 5ml肝素濃度為Img/ml的50mM Tris-HClCpH 7. 0，其中含IOmM CaCl2)緩沖液，移取20μ1酶液，搖勻后在232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據(jù)摩爾消光系數(shù)計算單位時間產(chǎn)生的雙鍵的摩爾數(shù)，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)，該方法測得的酶活為肝素酶的國際酶活單位。2) DMB法測酶活取固定化酶加入一定濃度的硫酸乙酰肝素底物，45°C水浴中反應5min，取樣，測定剩余硫酸乙酰肝素的濃度，測定方法為將未知濃度的硫酸乙酰肝素底物用50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)緩沖液稀釋一定倍數(shù)，在5ml玻璃比色皿中加入2. 5ml的DMB溶液，再加入25μ1稀釋后的硫酸乙酰肝素溶液，搖勻后測定525nm處的吸光值，根據(jù)DMB法測定肝素濃度的標準曲線求得酶解后剩余的硫酸乙酰肝素濃度，以每小時降解Img硫酸乙酰肝素所需的酶量為一個酶活單位，由此計算固定化酶的單位活性(U/ml)。232nm法是測定肝素酶III活性的最通用方法，可用于游離肝素酶III活性的測定，但用于固定化酶活性測定時微球帶來很大干擾而難以使用；DMB法可用于游離肝素酶III和固定化肝素酶III活性的測定。本發(fā)明中通過對相同濃度的游離肝素酶的DMB法和232nm法分別測定，得到兩種測定方法的換算關系，DMB法測得的酶活數(shù)值是232nm法測定數(shù)值的7. 45倍，以此對固定化的肝素酶酶活進行國際單位活性換算。
權利要求
1.一種肝素酶III的固定化方法，包括下述步驟 (1)肝素酶III溶液的制備選擇TriS-HCl緩沖液(pH7.O，含CaCl2)作為肝素酶III的溶齊U，將肝素酶III溶解在該緩沖液中，制得酶溶液； (2)肝素酶III與殼聚糖微球的交聯(lián)將殼聚糖微球用Tris-HCl緩沖液(pH7. O,含IOmM CaCl2)充分溶脹，再取步驟(1)獲得的肝素酶III溶液，將其加入該殼聚糖微球中，進行交聯(lián)； (3)用乙酸-乙酸鈉(pH6. 5-8. 0，含 NaCl ^PTris-HCKpH 6. 5-8. 0，含 CaCl2 和 NaCl)兩種緩沖液分別洗滌上述交聯(lián)后的殼聚糖微球，至洗脫液無酶活性； (4)利用還原劑處理步驟(3)中獲得的固定了肝素酶III的殼聚糖微球，隨后，如果需要，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶III。
2.根據(jù)權利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟(1中用于溶解肝素酶III的溶劑Tris-HCl 的濃度為 lO-lOOmM，CaCl2 濃度為 5-20mM。
3.根據(jù)權利要求2的固定化方法，其特征在于，步驟(1)中使用的Tris-HCl溶劑為50mM Tris-HCl (pH 7.0，含 IOmM CaCl2)0
4.根據(jù)權利要求1 3任一項的固定化方法，其特征在于，步驟(2)中使用的殼聚糖微球與肝素酶III溶液的體積比為1/10-10/1，更優(yōu)選1/5-5/1，最優(yōu)選1/2-2/1。
5.根據(jù)權利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中使用的乙酸-乙酸鈉緩沖液為 50-150mM 乙酸-乙酸鈉(pH 6. 5-8. 0，含 50-200mM NaCl)緩沖液。
6.根據(jù)權利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中使用的Tris-HCl緩沖液為.50mM Tris-HCl (pH 6· 5-8.0，含 IO-IOOmM CaCl2, 50-200mM NaCl)緩沖液。
7.根據(jù)權利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟(4)中使用的還原劑為堿金屬硼氫化物。
8.根據(jù)權利要求1的固定化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (la)、殼聚糖微球的制備 取殼聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將Span 80加入液體石蠟中，高速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入戊二醛作為交聯(lián)劑，交聯(lián)溫度為40°C，交聯(lián)完畢后加入2. 5M NaOH和無水乙醇(體積比1/1)的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復洗滌，即得殼聚糖微球； (1)配制緩沖液50mMTris-HCl (pH 7.0，含1OmM CaCl2),將其作為肝素酶III的溶劑，制得肝素酶III溶液，調(diào)整濃度至酶活力l-3IU/ml ； (2)取步驟(1獲得的肝素酶III溶液，將其加入用50mMTris-HCl (pH 7.0，含IOmMCaCl2)充分溶脹過的步驟(Ia)獲得的殼聚糖微球中，殼聚糖與肝素酶的體積比為1/2-2/1，4-10°C交聯(lián) 12-20h ； (3)配制IOOmM 乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，含 IOOmM NaCl)和 50mM Tris-HCl (pH 7.5，含50mM CaCl2, IOOmM NaCl)緩沖液，先后對交聯(lián)后的殼聚糖微球進行洗滌，緩沖液IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，含IOOmM NaCl)洗脫體積為殼聚糖微球體積的兩倍，然后用緩沖液50mM Tris-HCl (pH 7. 5，含50mM CaCl2, IOOmM NaCl)洗滌，收集洗脫液測酶活，直至洗脫液中無游離酶； (4)在固定了肝素酶III的殼聚糖微球中加入NaBH4l-5mg/ml,反應l-3h,反應完畢后，以50mM Tris-HCl (pH 7.0，含IOmM CaCl2)為緩沖液，對殼聚糖微球進行洗滌，所用緩沖液體積是 殼聚糖微球體積的3-5倍，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶 III。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肝素酶Ⅲ的固定化方法，尤其涉及一種以殼聚糖微球為固定化材料，對肝素酶Ⅲ進行固定化的方法。肝素酶Ⅲ固定化以后具有可回收、可重復利用、酶與底物和產(chǎn)物易分離等優(yōu)越性。
文檔編號C12N11/10GK102888390SQ201210423099
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權日2012年10月30日
發(fā)明者馬小來, 白佳珂, 史紹鵬, 李鋰 申請人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司