專利名稱：一種成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
肺纖維化是一種危害人民健康的嚴(yán)重疾病，死亡率高，目前尚無有效的治療方法。目前研究表明，肺纖維化發(fā)生中，上皮_間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是其重要的病理生理過程，而成纖維細(xì)胞生長因子II型受體(fibroblast growthfactor receptor 2,FGFR2) IIIb剪切體，即角質(zhì)細(xì)胞生長因子受體(Keratinocyte GrowthFactor Receptor, KGFR)，其表型的丟失是EMT發(fā)生的關(guān)鍵。目前，還缺乏成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，為肺纖維化提供基因治療的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，旨在解決目前還缺乏成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，不能為肺纖維化提供基因治療的方法的問題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，其特征在于，該構(gòu)建方法包括以下步驟FGFR2 IIIc表達(dá)載體的獲得與測(cè)序鑒定；FGFR2 IIIb 3-11外顯子片段的獲得；FGFR2 IIIb腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建；FGFR2 IIIb腺病毒的包裝。進(jìn)一步，所述FGFR2 IIIc 的插入位點(diǎn)為 5’XbaI/3’Hind III ;采用 Xba/Hind III從pRK5中切下FGFR2I He,同樣酶切位點(diǎn)插入pBluescriptll-SK質(zhì)粒；采用通用引物T3、T7對(duì)FGFR2 IIIc進(jìn)行了測(cè)序分析，通過與Pubmed公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)，證明目的基因片段確為FGFR2 IIIc0進(jìn)一步，所述FGFR2 IIIb 3_11外顯子片段的獲得方法依據(jù)Pubmed公布的基因序列,通過對(duì)FGFR2 IIIb及IIIc mRNA表達(dá)序列的分析，可以得知Pst I與Nhe I兩個(gè)唯一的酶切位點(diǎn)分別位于FGFR2的外顯子3與11上，SK載體上的Pst I已在FGFR2 IIIc片段插入時(shí)消失；取小鼠肺提取總RNA,采用引物 Pl (forward) 5’ -ttg tac tgc age tag gacgg-3’與引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增出 FGFR2 exon3至exonll之間的片段。通過膠回收法，提取目的片段；采用TA-Clone法擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增結(jié)果通過酶切法鑒定；在TA-Clone的PUC19載體上有一個(gè)EcoR V酶切位點(diǎn)， 而在FGFR2外顯子3到11片段上，僅在外顯子9上有一個(gè)EcoRV酶切位點(diǎn)，因此，擴(kuò)增產(chǎn)物如有2條帶即為FGFR2IIIc部分，如只有一條帶，即為FGFR2IIIb ；用Pst I與Nhe I從PUC19上切取FGFR2 IIIb外顯子3到11片段，并取代SK載體上的FGFR2 IIIc上的外顯子3到11片段，從而得到完整的FGFR2 IIIb表達(dá)載體；該FGFR2 IIIb表達(dá)載體同樣采用通用引物T3、T7對(duì)外顯子3_11部分進(jìn)行了測(cè)序分析，并與前述FGFR2 IIIc測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)分析，證實(shí)了我們所得載體確為FGFR2IIIb表達(dá)載體。進(jìn)一步，載體內(nèi)FGFR外顯子3至外顯子11的序列測(cè)序結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，其特征在于，該構(gòu)建方法包括以下步驟 FGFR2 IIIc表達(dá)載體的獲得與測(cè)序鑒定； FGFR2 IIIb 3-11外顯子片段的獲得； FGFR2 IIIb腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建； FGFR2 IIIb腺病毒的包裝。
2.如權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述FGFR2 IIIc的插入位點(diǎn)為5’XbaI/3’Hind III ;采用Xba/Hind III從pRK5中切下FGFR2 IIIc，同樣酶切位點(diǎn)插入pBluescriptll-SK質(zhì)粒；采用通用引物T3、T7對(duì)FGFR2 IIIc進(jìn)行了測(cè)序分析，通過與Pubmed公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)，證明目的基因片段確為 FGFR2 IIIc0
3.如權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述FGFR2 IIIb 3-11外顯子片段的獲得方法 依據(jù)Pubmed公布的基因序列，通過對(duì)FGFR2 IIIb及IIIc mRNA表達(dá)序列的分析，可以得知Pst I與Nhe I兩個(gè)唯一的酶切位點(diǎn)分別位于FGFR2的外顯子3與11上，SK載體上的Pst I已在FGFR2 IIIc片段插入時(shí)消失； 取小鼠肺提取總 RNA,采用引物 Pl (forward) 5’-ttg tac tgc age tag gacgg-3’與引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增出 FGFR2 exon3 至exonll之間的片段。通過膠回收法，提取目的片段； 采用TA-Clone法擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增結(jié)果通過酶切法鑒定；在TA-Clone的PUC19載體上有一個(gè)EcoR V酶切位點(diǎn)，而在FGFR2外顯子3到11片段上，僅在外顯子9上有一個(gè)EcoRV酶切位點(diǎn)，因此，擴(kuò)增產(chǎn)物如有2條帶即為FGFR2IIIC部分，如只有一條帶，即為FGFR2IIIb ； 用Pst I與Nhe I從PUC19上切取FGFR2 IIIb外顯子3到11片段，并取代SK載體上的FGFR2 IIIc上的外顯子3到11片段，從而得到完整的FGFR2 IIIb表達(dá)載體； 該FGFR2 IIIb表達(dá)載體同樣采用通用引物T3、T7對(duì)外顯子3-11部分進(jìn)行了測(cè)序分析，并與前述FGFR2 IIIc測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)分析，證實(shí)了我們所得載體確為FGFR2IIIb表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，其特征在于，載體內(nèi)FGFR外顯子3至外顯子11的序列測(cè)序結(jié)果如下
5.如權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，其特征在于，為使FGFR2 IIIb能成功進(jìn)入生物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，必須構(gòu)建FGFR2 IIIb腺病毒表達(dá)載體；應(yīng)用Xba/Hind III酶切位點(diǎn)從pSK-FGFR2 IIIb上切下FGFR2 IIIb片段，并轉(zhuǎn)入AdTrack-CMV載體中，構(gòu)建成含F(xiàn)GFR2_IIIb的腺病毒載體； pAdTrack-FGFR2_IIIb 載體構(gòu)建完成后，米用引物 Pl (forward) 5’ -ttg tactgc agetag gac gg_3，與引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，進(jìn)行了 PCR 及酶切鑒定； pAdEasy-1被存儲(chǔ)在BJ5183細(xì)菌中，參照分子克隆手冊(cè)制備AdEasy感受態(tài)細(xì)胞；將AdTrack-FGFR2-1IIb質(zhì)粒經(jīng)Pme I酶切線形化后，轉(zhuǎn)染AdEasy感受態(tài)細(xì)胞，線形化的AdTrack-FGFR2-1IIb 與 AdEasy-1 進(jìn)行同源重組形成 AdEasy-FGFR2_IIIb ； 提取AdEasy-FGFR2-1IIb質(zhì)粒進(jìn)行直接電泳和PCR鑒定，PCR鑒定時(shí)的正向引物位于第8外顯子上，結(jié)果表明pAdEasy-FGFR2-1IIb載體構(gòu)建正確。
6.如權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，其特征在于，F(xiàn)GFR2 IIIb腺病毒的包裝方法為將pAdEasy-FGFR2-1IIb感染293細(xì)胞，21天后收獲了原代的FGFR2-1IIb腺病毒(KGFR/AAV)。
7.如權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，其特征在于，F(xiàn)GFR2 IIIb (KGFR)/AAV擴(kuò)增后首先進(jìn)行了滴度測(cè)定與A549細(xì)胞感染率的檢測(cè)，并從mRNA水平、蛋白水平對(duì)KGFR/AAV病毒的KGFR表達(dá)進(jìn)行鑒定，鑒定方法為 步驟1，F(xiàn)GFR2 IIIb/AAV的滴度測(cè)定，采用96孔板熒光計(jì)數(shù)法檢測(cè)了 Ad-KGFR病毒原液的滴度為3 X 106PFU/mL ; 采用流式細(xì)胞儀陽性熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)了 Ad-KGFR病毒對(duì)A549細(xì)胞與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞感染的陽性率；感染72小時(shí)后，Ad-KGFR病毒原液對(duì)A549細(xì)胞的感染的陽性率為.95. 5%，對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞感染的陽性率為92. 8%。
步驟2，F(xiàn)GFR2 IIIb腺病毒在A549細(xì)胞中的表達(dá)，將收獲的KGFR/AAV感染A549細(xì)胞，兩天即可見陽性感染細(xì)胞；步驟3，KGFR-AAV病毒顆粒的電鏡觀察，透射電鏡觀察可見直徑約90微米的病毒顆粒; 步驟4，KGFR腺病毒表達(dá)KGFR的雙熒光鑒定，將KGFR腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞，陽性感染細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，采用KGFR抗體作為一抗、羅丹明標(biāo)記的IgG作為二抗，證明了小鼠成纖維細(xì)胞上KGFR的存在，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陰性； 步驟5，KGFR腺病毒表達(dá)KGFR的mRNA水平與蛋白水平鑒定，KGFR腺病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞72小時(shí)后，提取細(xì)胞mRNA與蛋白質(zhì)，采用RT-PCR與Western Blot的方法，對(duì)KGFR腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后的表達(dá)功能進(jìn)行了鑒定；采用KGFR腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞72小時(shí)后，提取細(xì)胞mRNA，進(jìn)行了 RT-PCR鑒定。
全文摘要
本發(fā)明一種成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構(gòu)建方法，包括以下步驟FGFR2 IIIc表達(dá)載體的獲得與測(cè)序鑒定；FGFR2 IIIb 3-11外顯子片段的獲得；FGFR2 IIIb腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建；FGFR2 IIIb腺病毒的包裝。利用本發(fā)明構(gòu)建的成纖維細(xì)胞生長因子II型受體IIIb剪切體，采用昆明白小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表明，博萊霉素60mg/kg體重氣管內(nèi)灌注在第3-4周能引起較明顯的肺纖維化發(fā)生；采用前述構(gòu)建的KGFR腺病毒表達(dá)載體，通過96孔板熒光計(jì)數(shù)法檢測(cè)Ad-KGFR病毒原液的滴度為3 106PFU/mL。以該滴度的KGFR腺病毒300ml與博萊霉素(60mg/kg體重)共同氣管內(nèi)灌注，分別于1，2，3，4周后HE染色觀察肺纖維化發(fā)生情況。結(jié)果表明，KGFR的表達(dá)增強(qiáng)后，博萊霉素作用后不同時(shí)間肺纖維化的發(fā)生有較明顯的減輕。
文檔編號(hào)C12N15/861GK103060375SQ20121042533
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者王建民, 陳菁, 劉斌劍, 陳魁君, 許川, 陳志強(qiáng), 李冠樺, 茍?jiān)?申請(qǐng)人:王建民