專利名稱：一種檢測dna中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)檢測方法。
背景技術(shù)：
表觀遺傳學(xué)被定義為研究基因表達(dá)水平(量變)信息的遺傳。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要形式。DNA甲基化與腫瘤有極大的關(guān)系。2003年，美國《science》雜志同期刊登的三篇文章已經(jīng)肯定了 DNA的總體低甲基化導(dǎo)致的基因不穩(wěn)定性對腫瘤的發(fā)生起著構(gòu)成原因的作用。在老鼠模型中，目前已經(jīng)證明從胚胎到成體發(fā)育過程中，利用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的突變導(dǎo)致染色體去甲基化，可以引起老鼠基因組不穩(wěn)定和導(dǎo)致淋巴瘤。一般來說。腫瘤細(xì)胞DNA總體甲基化水平低于正常細(xì)胞，但某些特定基因(如腫瘤抑制基因)CpG島卻處 于高甲基化狀態(tài)。DNA異常甲基化發(fā)生頻率高的分子可作為臨床監(jiān)控病程和評估療效的較好指標(biāo)。同時，DNA異常甲基化發(fā)生頻率高的分子也有望成為腫瘤早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。且在癌癥防治上，可防止癌變早期基因組穩(wěn)定性的發(fā)生，從而減少腫瘤易感性突變的可能，達(dá)到癌癥的早期預(yù)防。DNA甲基化同時還與單親遺傳病、老化等也有很大關(guān)系。隨著年齡的老化，基因組總體DNA甲基化水平逐漸降低?，F(xiàn)有的甲基化化學(xué)檢測方法主要有亞硫酸氫鈉法、鋨酸鉀法及高碘酸鈉法，但是亞硫酸氫鈉法雖然檢測時有較高的精確度，但是相對來說較為繁瑣，且費時較長。鋨酸鉀法不能區(qū)分胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶。而高碘酸鈉法仍是會對少量的胸腺嘧啶的有氧化作用，因此高碘酸鈉法的檢測需進(jìn)一步的完善以提高檢測精度。相對于Maxam-GiIbert的化學(xué)測序法做C帶用肼的方法,本發(fā)明采用了更安全、有效、無毒的試劑即對硝基苯磺酰氯胺鈉鹽和基本無毒的試劑即間硝基苯磺酰溴胺鈉鹽。檢測DNA甲基化還有其他的方法，如將DNA降解為單核苷酸后采用化學(xué)分析儀器如液相色譜和質(zhì)譜等進(jìn)行分析，還有采用特異性甲基化限制性內(nèi)切酶使DNA部分降解在通過southern印記法檢測DNA中5-甲基胞嘧啶。然而這些方法檢測5-甲基胞嘧啶的精確度有待于進(jìn)一步的提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種方便、快速和精確度高的檢測5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，包括以下步驟I)取代的苯磺酰氯胺鈉鹽與帶熒光標(biāo)記的DNA樣品中的胞嘧啶反應(yīng)以乙腈為溶齊IJ，分別加入緩沖溶液、催化劑和取代的苯磺酰氯胺鈉鹽溶液，振蕩離心，加入DNA樣品后進(jìn)行孵育；
2)取代的苯磺酰溴胺鈉鹽與帶熒光標(biāo)記的DNA樣品中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反應(yīng)以乙腈為溶劑，分別加入緩沖溶液、去離子水、取代的苯磺酰溴胺鈉鹽溶液，震蕩離心,加入DNA樣品后進(jìn)行孵育；3)確定5-甲基胞嘧啶的位置和個數(shù)將步驟I)和2)孵育后的DNA樣品除鹽三次，再用哌啶處理，震蕩離心后干燥，再將處理后的DNA樣品上樣，比較DNA聚丙烯酰胺變性膠中兩個反應(yīng)的DNA帶，記錄5-甲基胞嘧啶的位置和個數(shù)。取代的苯磺酰氯胺鈉鹽為對硝基苯磺酰氯胺鈉鹽I，取代的苯磺酰溴胺鈉鹽為間硝基苯磺酰溴胺鈉鹽II，I和II的結(jié)構(gòu)式分別為
權(quán)利要求
1.一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，其特征在于，包括以下步驟 1)取代的苯磺酰氯胺鈉鹽與帶熒光標(biāo)記的DNA樣品中的胞嘧啶反應(yīng)以乙腈為溶劑，分別加入緩沖溶液、催化劑和取代的苯磺酰氯胺鈉鹽溶液，振蕩離心，加入DNA樣品后進(jìn)行孵育； 2)取代的苯磺酰溴胺鈉鹽與帶熒光標(biāo)記的DNA樣品中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反應(yīng)以乙腈為溶劑，分別加入緩沖溶液、去離子水和取代的苯磺酰溴胺鈉鹽溶液，震蕩離心，力口入DNA樣品后進(jìn)行孵育； 3)確定5-甲基胞嘧啶的位置和個數(shù)將步驟I)和2)孵育后的DNA樣品除鹽三次，再用哌啶處理，震蕩離心后干燥，再將處理后的DNA樣品上樣，比較DNA聚丙烯酰胺變性膠中兩個反應(yīng)的DNA帶，記錄5-甲基胞嘧啶的位置和個數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，其特征在于所述的取代的苯磺酰氯胺鈉鹽為對硝基苯磺酰氯胺鈉鹽I，取代的苯磺酰溴胺鈉鹽為間硝基苯磺酰溴胺鈉鹽II，I和II的結(jié)構(gòu)式分別為
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，其特征在于，所述的緩沖溶液為I μ IlOOmM的Tris-HCl緩沖溶液，pH為5。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，其特征在于，所述的催化劑為I μ IlOOmM的I2溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，其特征在于，所述的取代的苯磺酰氯胺鈉鹽溶液和取代的苯磺酰溴胺鈉鹽溶液的體積均為I μ 1，濃度均為20mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，其特征在于，所述的去離子水的體積為I μ I。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，其特征在于，所述的DNA樣品的體積為2 μ I,濃度為10 μ Μ。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法，該方法采用的兩種化合物分別為取代的苯磺酰氯胺鈉鹽和取代的苯磺酰溴胺鈉鹽，具體檢測步驟如下先用取代的苯磺酰氯胺鈉鹽與帶熒光標(biāo)記的DNA中的胞嘧啶反應(yīng)，再用取代的苯磺酰溴胺鈉鹽與帶熒光標(biāo)記的DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反應(yīng)，然后用哌啶處理，通過比較DNA聚丙烯酰胺變性膠中兩個反應(yīng)的DNA帶，可以清楚的看到5-甲基胞嘧啶的位置和個數(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK102912024SQ20121042748
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月30日
發(fā)明者周翔, 王天露, 翁小成 申請人:武漢大學(xué)