專(zhuān)利名稱(chēng)：郁金香二氫黃酮醇-3′-羥化酶TfF3′H蛋白及其編碼基因和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及郁金香花色苷合成途徑中的關(guān)健酶及其編碼基因和探針，具體涉及一種郁金香二氫黃酮醇-3' _羥化酶TfF3' H蛋白及其編碼基因和探針。
背景技術(shù)：
花的顏色是影響植物傳粉的重要因素，同時(shí)也決定一種花卉的商品價(jià)值和觀賞價(jià)值。改變花色，創(chuàng)造新花色，可以增加花卉的商品價(jià)值和觀賞價(jià)值?；ǘ涞念伾腔ò昙?xì)胞 中積累花色素的結(jié)果，花色素主要包括類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素以及甜菜堿類(lèi)。類(lèi)黃酮是花色素的一大類(lèi)，它使花朵產(chǎn)生從黃到紫的全部顏色。在類(lèi)黃酮的合成途徑中，黃烷酮經(jīng)黃烷酮-3-羥化酶(F3H)催化羥化形成二氫黃酮醇，二氫黃酮醇可以在二氫黃酮醇3，-羥化酶(flavonoid3/ hydroxylase, F3' H)和二氫黃酮醇3' ,5'-輕化酶的催化作用下分別形成二氫櫟皮酮和二氫楊梅黃酮。前者最終產(chǎn)生基于矢車(chē)菊素的磚紅到紫紅的色素；后者最終產(chǎn)生基于飛燕草素的從紫色到藍(lán)色的色素。如果二氫黃酮醇在3'和5'都沒(méi)有被羥化則轉(zhuǎn)變?yōu)榇u紅色的天竺葵色素。當(dāng)F3' H失活時(shí)，花中不會(huì)積累矢車(chē)菊色素苷，而積累更多天竺葵色素，使花更多地呈現(xiàn)橙紅色。因此，F(xiàn)3' H基因的表達(dá)活性會(huì)直接影響花朵的最終顏色，對(duì)F3' H基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控是改變花色的途徑之一。F3 ' H基因已在多種植物中得到克隆，但在郁金香(Tulipa fosteriana)中，F(xiàn)3/ H基因的克隆、表達(dá)模式及F3' H蛋白編碼序列目前尚不清楚。目前，未有任何與郁金香F3' H蛋白及其編碼基因序列相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于填補(bǔ)郁金香F3' H基因家族成員的克隆、表達(dá)模式分析以及郁金香F3' H蛋白及其編碼基因的空白，提供了一種郁金香TfF3' H蛋白，本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列以及檢測(cè)所述核酸序列的探針。本發(fā)明公開(kāi)了郁金香TfF3' H蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，為今后利用基因工程技術(shù)調(diào)控TfF3' H基因的表達(dá)模式，從而改變花色、創(chuàng)新花色提供了理論依據(jù)，具有重大的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一方面，本發(fā)明提供了一種具有郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是由如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或由SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在花朵花瓣的不同著色階段、不同器官內(nèi)的有無(wú)及活性大小存在較大差異。優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)I 50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個(gè)以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列中I 10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。優(yōu)選的，所述核酸序列具體為Ca)堿基序列如SEQ ID NO. 3第I 1533位所示；或(b)與SEQ ID NO. 3第I 1533位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能與SEQ ID NO. 3第I 1533位所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ ID NO. 3第I 1533位所示的核酸序列中I 90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個(gè)以內(nèi)核苷酸形成的序列。此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述核酸序列8 100個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子，該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼郁金香F3/ H相關(guān)的核酸分子。本發(fā)明提供的分尚出的DNA分子,該分子包括具有SEQ ID NO. 3所不核苷酸序列的DNA分子；或者編碼具有郁金香TfF3' H蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且與SEQ IDNO. 3所示序列有至少70%的同源性；或者能與SEQ ID NO. 3所示序列的核苷酸序列雜交。在本發(fā)明中，“分離的DNA”、“純化的DNA”是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開(kāi)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶蛋白編碼序列”指編碼具有郁金香TfF3' H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO. 3所示序列中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO. 3所示序列的同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO. 3所示序列中從核苷酸第I 1533位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的郁金香TfF3' H相同功能的蛋白的SEQ IDNO. 3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)通常為I 90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個(gè)以內(nèi)核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶TfF3' H蛋白”是指具有郁金香TfKV H蛋白活性的SEQ ID NO. 4所示序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然郁金香TfKV H相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO. 4所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)通常為I 50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或?yàn)?0個(gè)以內(nèi)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括郁金香TfF3' H蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的郁金香TfF3' H多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與郁金香TfKV H相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用郁金香TfF3' H多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“郁金香TfF3' H保守性變異多肽”指與SEQ ID NO. 4所示序列的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表I 最初的殘基~I代表性的取代I優(yōu)選的取代
Ala(A)Val; Leu; HeVal
Arg(R)Lys;Gin;AsnLys
Asn (N)Gln;His;Lys;ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys(C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu (E)AspAsp
Gly(G)Pro;AlaAla
His (H)Asn;Gin;Lys;ArgArg
He (I)Leu; Val; Met; Ala; PheLeu
Leu (L)He; Val; Met; Ala; Phelie
Lys(K)Arg;Gin;AsnArg
Met (M)Leu;Phe;lieLeu
Phe(F)Leu; Val; He;Ala;TyrLeu
Pro (P)AlaAla
Ser(S)ThrThr
Thr(T)SerSer
Trp(W)Tyr;PheTyr
Tyr(Y)Trp;Phe;Thr;SerPhe
Val (V)He; Leu; Met; Phe; AlaLeu
發(fā)明還包括郁金香TfF3' H蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與郁金香TfF3' H相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得至IJ，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化 了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析郁金香TfF3' H基因產(chǎn)物的表達(dá)模式，即分析TfF3' H基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。本發(fā)明檢測(cè)樣品中是否存在郁金香TfF3' H相關(guān)核苷酸序列的檢測(cè)方法，包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于郁金香TfF3' H相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15 50個(gè)核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的郁金香TfF3' H核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選郁金香TfF3' H相關(guān)同源基因或同源蛋白。為了得到與郁金香TfF3' H相關(guān)基因的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選郁金香cDNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對(duì)郁金香TfKV H相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自郁金香的文庫(kù)。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買(mǎi)到，例如購(gòu)自Clontech, Stratagene, Palo Alto, Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與郁金香TfF3' H相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的郁金香TfF3' H相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。在獲得了有關(guān)序列后，可用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變弓I入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co. , SanFrancisco;Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。利用本發(fā)明的郁金香TfF3' H蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與郁金香TfKV H相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。郁金香為世界十大切花之一，觀賞價(jià)值極高，應(yīng)用廣泛，人們對(duì)新花色的需求也越來(lái)越大。首次克隆郁金香花瓣類(lèi)黃酮合成通路分支點(diǎn)處的關(guān)鍵酶二氫黃酮醇-3' _羥化酶TfKV H蛋白的編碼序列，并采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法分析TfF3' H基因的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，為利用基因工程技術(shù)對(duì)TfF3' H基因的表達(dá)模式進(jìn)行調(diào)控從而改變花色，培育新花色品種提供了理論依據(jù)，具有重大的應(yīng)用價(jià)值。


通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯圖I為本發(fā)明的郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶TfF3' H基因與百合二氫黃酮醇-3'羥化酶基因mRNA的核苷酸序列的同源比較(GAP)結(jié)果；圖2為本發(fā)明的郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶TfF3' H基因與百合二氫黃酮醇-3'羥化酶基因mRNA的核苷酸序列的同源比較(GAP)結(jié)果；圖3為本發(fā)明的郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶TfF3' H基因與百合二氫黃酮醇-3'-羥化酶基因mRNA的核苷酸序列的同源比較(GAP)結(jié)果；圖4為本發(fā)明的郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶TfF3' H與百合二氫黃酮醇-3'-羥化酶的氨基酸序列的同源比較(FASTA)結(jié)果，其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I、郁金香TfF3' H基因的克隆I.植物材料的獲得將健康、大小一致的郁金香球莖(Tulipa fosteriana‘Shangnongzaoxia’，已通過(guò)上海市農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。編號(hào)滬農(nóng)品認(rèn)花卉2011第004號(hào))按常規(guī)種植并進(jìn)行田間管理，待花朵完全開(kāi)放，花瓣完全著色時(shí)采集花瓣組織，用于提取RNA ；2. RNA 的抽提利用“RNAprep pure 植物總 RNA 提取試劑盒”抽提總 RNA (RNA prep pure PlantKit :天根生化科技(北京)有限公司)。用甲醛變性膠電泳鑒定RNA的完整性，然后在分光光度計(jì)(Thermo Scientific NANODROPlOOOSpectrophotometer)上測(cè)定 RNA 的純度及濃度；3.基因的全長(zhǎng)克隆
根據(jù)其它物種中F3' H基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 :寶生物工程(大連)有限公司，SMARTer RACEcDNA Amplification Kit:Clontech Laboratories, Inc.)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(I) RT-PCR獲得基因中間片段將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit-S生物工程(大連)有限公司)，以第一鏈cDNA為模板，利用引物Fl (SEQ ID NO. I)和Rl (SEQID NO. 2)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到約IOOObp片段，回收并連接到pMD18_T Simplevector載體上，用RV-M和M13-47作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行 BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)比對(duì)已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank),知其核酸序列及編碼蛋白與已知的百合屬二氫黃酮醇-3' _羥化酶基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)二氫黃酮醇-3' _羥化酶基因； (2)3' RACE端的序列通過(guò)使用:V -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 :寶生物工程(大連)有限公司獲得，二輪巢式PCR完成3'末端序列的擴(kuò)增第一輪Auterprimer+FS' H3_l(5' -CTTCCACATCCCCAAGCACGCCACT-3')第二輪dnnerprimer+FS' H3-2 (5' -GTGGAGTTCAAGCCTTCCCGGTTCA-3')Outerprimer 和 Innerprimer 為試劑盒提供。3' RACE 得到 TfF3' H 的 3'末端序列(476bp)，回收，連接到pMD18-T Simple vector載體上，用RV-M和M13-47作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer, USA)的方法，在ABI377測(cè)序儀(Perkin-Elmer, USA)上進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果通過(guò)在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST (http://blast.ncbi. nlm. nih. gov/)比對(duì)已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank),知其核酸序列及編碼蛋白與已知的百合屬二氫黃酮醇-3'-羥化酶基因的同源性高；(3)5' RACE5'端的序列通過(guò)使用 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 獲得，以 5' RACEready cDNA為模板，通過(guò)二輪巢式PCR獲得第一輪UPM+F3'H5-1 (5' -GACTGCGGGGTCTCGAGCAATGG-3')第二輪NUP+F3'H5-2 (5' -ACCAGCACACTCAGCAAATCCCTCCCA-3')UPM和NUP為試劑盒提供。5' RACE擴(kuò)增獲得TfF3' H的5'末端序列(836bp)，回收連接后用同上面一樣的方法進(jìn)行測(cè)序；將通過(guò)上述3種方法獲得的序列的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，將拼接序列提交BLAST分析，結(jié)果證明從郁金香中新得到的TfF3' H基因確為一個(gè)與二氫黃酮醇-3'-羥化酶相關(guān)的基因。將測(cè)序結(jié)果結(jié)合 NCBI 的 ORF Finding (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了郁金香TfKV H基因的起始密碼子與終止密碼子，根據(jù)獲得的序列，分別從起始密碼子和終止密碼子處設(shè)計(jì)特異性引物ORF-F (5' ATGGAAGCTCAACCTCTCCTCCT-3 ')，ORF-R (5 ' -TCACTCCTTCCCATACGCCCTCGCT-3 ')，以郁金香 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增得到1533bp郁金香TfF3' H蛋白的全長(zhǎng)編碼基因序列(SEQ ID NO. 3)。實(shí)施例2、郁金香TfF3' H基因的序列信息與同源性分析
本發(fā)明新的郁金香TfF3' H全長(zhǎng)⑶S開(kāi)放讀碼框序列為1533bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQID NO. 3所示序列；根據(jù)⑶S開(kāi)放讀碼框序列推導(dǎo)出郁金香TfKV H的氨基酸序列，共510個(gè)氨基酸殘基，分子量為55482. 2道爾頓，等電點(diǎn)(pi)為6. 98，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO. 4所示序列；將郁金香TfF3! H的⑶S開(kāi)放讀碼框序列及其編碼蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與百合F3' H基因(GenBank登陸號(hào)AB699162. I)在核苷酸水平上具有82%的相同性，如圖I、圖2和圖3所示(Query :郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶TfF3' H的編碼基因序列；Sbjct :百合二氫黃酮醇-3'-羥化酶的mRNA序列)；在氨基酸水平上，它與百合F3' H基因(GenBank登陸號(hào)BAM28972. I)也有88%的一致性和94%的相似性，如圖4所示(Query 郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶TfF3' H的氨基酸序列；Sbjct :百合二氫黃酮醇-3'-羥 化酶的氨基酸序列)。由此可見(jiàn)，郁金香TfF3' H基因與百合F3' H基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。實(shí)施例3、郁金香F3' H基因在花朵不同發(fā)育階段及在郁金香不同組織中的表達(dá)差異性I.材料的獲得在郁金香花朵的4個(gè)不同發(fā)育階段(花蕾，花瓣未著色；花蕾，花瓣開(kāi)始著色；花朵部分開(kāi)放，花瓣未完全著色；花朵完全開(kāi)放，花瓣完全著色)，于田間采取其花瓣，同時(shí)采取其葉片、地上莖、花部器官雄蕊、雌蕊、花瓣(各著色階段花瓣的混合樣)，將樣品分別用鋁鉬紙包好后立刻投入液氮中，接著轉(zhuǎn)入_80°C超低溫冰箱中貯存待用；2. RNA 的提取利用 RNA prep pure植物總 RNA提取試劑盒(RNA prep pure PlantKit :天根生化科技(北京)有限公司)提取郁金香不同發(fā)育階段花朵的花瓣以及不同組織中的 RNA ；3. RNA的完整性、純度、濃度的確定用普通瓊脂糖凝膠電泳(膠濃度I. 2% ；
0.5XTBE電泳緩沖液；150v，15min)檢測(cè)完整性；電泳條帶中最大rRNA亮度應(yīng)為第二條rRNA亮度的I. 5-2. 0倍，否則表示rRNA樣品的降解。純度較好的RNA，A260A280以及A26tl/A230約為2. 0左右；用分光光度計(jì)測(cè)定OD值并計(jì)算RNA含量；4. cDNA的獲得以500ng的總RNA為模板，按照寶生物公司TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA備用；5.設(shè)計(jì)特異性引物以進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因在各器官與組織中的表達(dá)量根據(jù)已經(jīng)獲得的郁金香Tf3 ' H基因的序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier5. 0設(shè)計(jì)用于Real-time PCR中郁金香TfF3' H基因定量分析的特異性引物F3 ' H-F(5' -CCTTCCTCCMGCCATCA-3')和 F3, H_R(5, -GTCGCTACCTTTCACATCCA-3')，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin (GenBank 登陸號(hào) AB456684)，其引物為 Actin-F (5' -AGTCAGTCATACAGTGCCMTC-3')，Ac t i n-R (5' -TCATMGAGAGTCGGTCMATCC-3')；6.制作目的基因及內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線用EASY Dilution (試劑盒提供)將標(biāo)準(zhǔn)品cDNA溶液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓蠓謩e以稀釋后的cDNA溶液為模板，以目的基因及內(nèi)參基因的特異性引物進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線；分析溶解曲線，判斷目的基因及內(nèi)參基因的溶解曲線是否得到單一峰，以判斷使用該引物能否得到單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定模板cDNA的合適稀釋倍數(shù)；
7.待測(cè)樣品中目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析以合成的cDNA第一條鏈為模板，分別用目的基因與內(nèi)參照基因的特異性引物擴(kuò)增進(jìn)行熒光定量分析，Real-time PCR反應(yīng)在BIO-RAD Chromo4實(shí)時(shí)定量?jī)x上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 y L反應(yīng)采用三步法，94°C變性20s，接著41個(gè)循環(huán)94°C 15s ；56°C 15s ；72°C 25s ;每次擴(kuò)增完成后，均做溶解曲線，以檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物是否為特異產(chǎn)生；8.采用2_AAGt法作相對(duì)定量分析，結(jié)果表明TfF3' H基因的表達(dá)水平隨著花朵的發(fā)育逐漸上升緩緩上升?；ò晖耆珪r(shí)TfKV H的表達(dá)量為花瓣剛著色階段表達(dá)量的2. 6倍，說(shuō)明該基因的表達(dá)與花瓣的著色有相關(guān)性；TfF3' H基因在莖、葉、雄蕊、雌蕊、花瓣中均有表達(dá)。其中，TfF3' H基因在雄蕊中表達(dá)量最高，在葉片中表達(dá)量最低，表達(dá)水平 從高到低依次為雄蕊、雌蕊、花瓣、莖、葉，這說(shuō)明TfF3' H基因的表達(dá)具有明顯的空間差異性。
權(quán)利要求
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)由如SEQID NO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)SEQID NO. 4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有郁金香二氫黃酮醇-3'-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQID NO. 4所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)I 50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20個(gè)以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQID NO. 4所示氨基酸序列中I 10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的核酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為 Ca)堿基序列如SEQ ID NO. 3第I 1533位所示； 或(b)與SEQ ID NO. 3第I 1533位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID NO. 3第I 1533位所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。
6.如權(quán)利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為SEQID NO. 3第I 1533位所示的核酸序列中I 90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在Y和/或:V端添加60個(gè)以內(nèi)核苷酸形成的序列。
7.一種用于檢測(cè)如權(quán)利要求4所述核酸序列的探針，其特征在于，所述探針為包含有所述核酸序列8 100個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種郁金香二氫黃酮醇-3′-羥化酶TfF3′H蛋白及其編碼基因和探針，所述蛋白質(zhì)為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有郁金香二氫黃酮醇-3′-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列，以及檢測(cè)上述核酸序列的探針；本發(fā)明為利用基因工程技術(shù)對(duì)郁金香TfF3′H基因的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行調(diào)控，從而改變花色、創(chuàng)新花色提供了理論依據(jù)，具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102965349SQ201210429398
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)