專利名稱：：鏈霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一個鏈霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B，該基因編碼的蛋白質(zhì)在降解纖維素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：纖維素是植物中最廣泛存在的骨架多糖，是世界上最豐富的可再生的天然有機(jī)物(高潔，湯烈貴，1996，纖維素科學(xué)，科學(xué)出版社，27-28.)。纖維素具有由β_1，4-糖苷鍵連接單糖而形成晶體結(jié)構(gòu)，必須轉(zhuǎn)化成微生物可利用的形式(如葡萄糖、乙醇等化合物)才能生物轉(zhuǎn)化成能源或生物化工產(chǎn)品(李旺，劉輝，李恒新等，2007，纖維素酶產(chǎn)生菌DR的篩選和優(yōu)化培養(yǎng)，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，3:170-172.)。用纖維素酶水解纖維素對環(huán)境沒有任何污染，使得豐富的生物質(zhì)資源可以通過生物轉(zhuǎn)化變成綠色能源或可再生的生化產(chǎn)品(RizzattiACSA，JorgeJA,TerenziHF，etal，2001，Purificationandpropertiesofathermostableextracellularβ-D-xylosidaseproducedbyathermotolerantAspergillusphoenicis.JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology，26:156-160.)。纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，任何一種單一的酶都難以高效地水解它，能降解天然纖維素的纖維素酶是一個復(fù)雜的多酶體系。自然界中廣泛地存在著能降解纖維素的微生物，它們種類繁多，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等(杜風(fēng)光，史吉平，張龍等，2009，纖維質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化研究進(jìn)展，2972-73.)。細(xì)菌類有紅黃纖維弧菌(Cellvibriofulvus)、普通纖維弧菌(C.vulgaris)等。細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶一般為胞內(nèi)酶，并且產(chǎn)量比較低，主要產(chǎn)生中性纖維素酶和堿性纖維素酶。纖維單胞菌和高溫單胞菌是被廣泛研究的兩種產(chǎn)生纖維素酶的細(xì)菌(李明華，張大偉，楚杰等，2006，飼料纖維素酶的研究與應(yīng)用進(jìn)展，新飼料，7:65-68.);放線菌類有鏈霉屬(Streptomyces)QMB814、高溫放線菌屬(Thernoactinomycete)和Theremomonosporacurvata等；真菌類有黑曲霉(Aspergillusniger)、血紅栓菌(Trametessanguinea)、臥孔屬(Poria)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、綠色木霉(Trichldermaviride)、里氏木霉(T.reesei)等，其中里氏木霉和黑曲霉是目前應(yīng)用最廣的纖維素酶生產(chǎn)菌(TangB,PanHB,ZhangQQ,etal,2009,CloningandexpressionofcellulosegeneEGIfromRhizopusstolonifervar.reftexusTP_02inEscherichiacoli.BioresourceTechnology,100:6128-6132.)。除此之外，國內(nèi)外還嘗試了應(yīng)用基因工程技術(shù)來改造和構(gòu)建高效纖維素降解菌(林麗華，秦國梅，韋宇拓等，2OO9，臺灣家白蟻內(nèi)切葡聚糖酶活性中心氨基酸的飽和突變，生物工程學(xué)報，25(6):927-931.)，同時發(fā)現(xiàn)部分動物體內(nèi)也可以產(chǎn)生纖維素酶，如牛的胃、木蠹蛾的唾液和蝸牛的胃液等都含有豐富的纖維素酶(DuanCJ,FengJX.,2010,Miningmetagenomesfornovelcellulasegenes.BiotechnolLett.32(12):1765-75.)。纖維素酶是能夠?qū)⒗w維素降解成葡萄糖的一組酶的總稱，它是一類復(fù)雜水解酶的復(fù)合物，稱為纖維素酶系(宋波，鄧曉峯，2003，纖維素酶的研究進(jìn)展，22(7)=419-495.)。一般可以分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。(I)內(nèi)切葡聚糖酶是從纖維素分子非結(jié)晶區(qū)域羧甲基纖維素水解產(chǎn)生大量小分子纖維素；(2)外切葡聚糖酶是從纖維素鏈末端水解產(chǎn)生纖維二糖分子；(3)葡萄糖苷酶水解纖維二糖分子和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖。學(xué)者普遍認(rèn)為纖維素被纖維素酶徹底水解是這三種酶協(xié)同作用的結(jié)果(KudoH,ChengKJ,CostertonJff,1987,Electronmicroscopicstudyofthemethylcellulose-mediateddetachmentofcellulyticrumenbacteriafromcellulosefibers,33:267-270.)。目前，纖維素酶已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于多個領(lǐng)域，主要有食品、釀酒、環(huán)保、飼料加工、紡織、農(nóng)業(yè)、日化等方面。在水果和蔬菜加工中由于植物細(xì)胞壁的主要成分是果膠、纖維素和半纖維素等，因此，在水果與蔬菜加工的過程中適當(dāng)使用纖維素酶，可將纖維素水解成葡萄糖等有效成分。另一方面，還可使植物細(xì)胞壁發(fā)生不同程度變化，如軟化、膨脹、崩潰等，提高果蔬的可消化性，并使其口感更好；在白酒及其酒精生產(chǎn)中以纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精，使用的是二段法，即先用纖維素酶將纖維素糖化，再經(jīng)酵母發(fā)酵成酒精；在茶葉加工中用酶法低溫抽提，即先用纖維素酶將茶葉的細(xì)胞壁裂解抽提其中的有效成分，最后將·高有效成分的得率，同時還可保持茶葉原有的色香味；在活性物質(zhì)的提取中，如淀粉、蛋白質(zhì)、活性多糖等物質(zhì)的提取過程中，加入纖維素酶能大幅提高產(chǎn)品的收率(杜翠嬌，任河，杜建敏等，2011，纖維素酶及其應(yīng)用，食品工程，26-7.)以內(nèi)切葡聚糖酶為關(guān)鍵詞查找國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共出現(xiàn)69項(xiàng)發(fā)明專利。其中有23項(xiàng)發(fā)明專利是描述編碼內(nèi)切葡聚糖酶的基因及其應(yīng)用，而其他46項(xiàng)是與內(nèi)切葡聚糖酶在各種領(lǐng)域上的應(yīng)用有關(guān)。在這23項(xiàng)與編碼內(nèi)切葡聚糖酶的基因及其應(yīng)用相關(guān)的發(fā)明專利中的內(nèi)切葡聚糖酶基因分別來自于各種細(xì)菌、霉菌、未培養(yǎng)微生物或人工合成的，在這23項(xiàng)專利中還沒有一個內(nèi)切葡聚糖酶基因是來自于鏈霉菌的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明從廣西南寧篩選到的鏈霉菌GX6的基因組中克隆到一個來自鏈霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因，在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶，并能以纖維素為原料降解生成葡萄寡糖。本發(fā)明涉及一個來自鏈霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B，具有序列表中SEQIDNO1所述的堿基序列，是從鏈霉菌GX6的基因組中克隆得到。該內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B的序列是由1389個堿基組成，含有完整的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B的開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF),Cel5B基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)是基因Cel5B編碼的內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)物Cel5B，由462個氨基酸組成，和Cel5B催化功能域同源性最高的是與Streptomycessp.el4(鏈霉菌el4)的endoglucanaseCelA(內(nèi)切葡聚糖酶CelA)，兩者的一致性=402/467(86%)，相似性=419/467(90%)?；駽el5B在大腸桿菌中表達(dá)的重組產(chǎn)物Cel5B能夠分解纖維素。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體，及用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明基因的宿主。本發(fā)明提供了一個來自鏈霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因，該基因所編碼的內(nèi)切葡聚糖酶具有分解纖維素的用途。圖I是篩選含有內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B重組菌株的CMC選擇平板圖。圖2是內(nèi)切葡聚糖酶Cel5B的SDS-PAGE圖。從圖I了解到，含有內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B的重組菌株能夠在CMC選平板上形成透明圈。圖2了解到，內(nèi)切葡聚糖酶Cel5B純化物的分子量為49.2kDa。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施方法是為了更好的解釋本發(fā)明，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明的目的。在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichiacoli)株系XLl-blue(購自TaKaRa公司)，表達(dá)載體pQE30和表達(dá)宿主M15(購自Qiagen公司)，CMC(carboxylmethylcellulose,竣甲基纖維素納，購自Sigma公司)以及購自TaKaRa、MBI的限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑。下面將通過實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述I)鏈霉菌StreptomycesGX6基因組DNA的提取鏈霉菌Sti^ptomycesGX6的基因組DNA是按照BioFlux公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒BiospinBacteriaGenomicDNAExtractionKit(目錄號BSC12S1)的使用說明來提取的。將提取好的鏈霉菌Sti^ptomycesGX6的基因組DNA送華大基因公司測定基因組序列。2)鏈霉菌Sti^ptomycesGX6的基因組序列中編碼內(nèi)切葡聚糖基因序列的分析將獲得的鏈霉菌StreptomycesGX6的基因組序列用NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的軟件ORFfinder(http://www.ncbi.nlm.nih.Rov/Rorf/orfiR.cri)和Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行分析。結(jié)果共獲得3個與內(nèi)切葡聚糖酶具有較高同源性的開放閱讀框(OpenReadingFrame,0RF),本發(fā)明只涉及其中一個0RF。3)內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B的核苷酸序列分析基因Cel5B的開放閱讀框(OpenReadingFrame,0RF)由1389個核苷酸組成,序列如SEQIDNO:1。其中，Cel5B基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。4)內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B編碼的產(chǎn)物Cel5B的氨基酸序列分析內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B編碼一個含462個氨基酸的蛋白質(zhì)，用DNAStar軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為49255.09道爾頓。用簡單組件結(jié)構(gòu)研究工具(SimpleModularArchitectureResearchTool,SMART,http://smart,embl-heidelberg.de)分析內(nèi)切葡聚糖酶Cel5B的組件結(jié)構(gòu)，結(jié)果是自N端的I一32位氨基酸殘基為信號肽序列、36-136位氨基酸殘基為碳水化合物結(jié)合功能域II(CBD_II)、166—424位氨基酸殘基為纖維素酶功能域(Pfam:Cellulase)。5)內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B的克隆和表達(dá)使用上游引物5’-ATAGGATCCGCCACCGGCTGCCGGGTCGACTACAC-3’(含有BamHI位點(diǎn))和下游引物5’-AGTAAGCTTTCAGTTGGTGGGGAAGTTGTCCGGAG-3’(含有HindIII位點(diǎn))，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B，用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII酶切內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B后，與經(jīng)BamHI和Hindi11酶切的表達(dá)載體pQE30進(jìn)行連接。再將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-blue中，涂布到含100μg/mL氨芐青霉素的LA平板上。轉(zhuǎn)化得到的單菌落點(diǎn)板至含有100μg/mL氨芐青霉素和O.5%(ff/V)CMC(羧甲基纖維素鈉)的LA平板上，將平板置于37°C恒溫箱培養(yǎng)5小時，對每個轉(zhuǎn)點(diǎn)菌落逐個滴加Iμ11%(ff/V)的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后將平板置于37°C恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)5小時。時間到后，進(jìn)行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37°C恒溫箱使表達(dá)的Cel5B酶與CMC反應(yīng)8小時。用O.1%的剛果紅溶液染色15分鐘后，再用IM的NaCl溶液脫色。觀察選擇平板。然后進(jìn)一步提取在選擇平板上能形成透明圈的克隆子的質(zhì)粒DNA，并將其命名為pQE-Cel5B，用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII完全酶切pQE_Cel5B后，進(jìn)行O.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果pQE-Cel5B除有一個約3.4kb的DNA片段外，還有一條大小約為I.3kb的·DNA片段。將質(zhì)粒pQE_Cel5B用CaCl2法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)宿主M15中，涂布到含100μg/mL氨芐青霉素和25μg/mL卡那霉素的LA平板上。挑取轉(zhuǎn)化得到的單菌落接種到含100μg/mL氨芐青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，待OD6tltl為O.4時，加入IPTG使其終濃度為O.5mmol/L,37°C、180轉(zhuǎn)誘導(dǎo)8小時。IlOOOrpm離心3min，收集菌體，用4mLpH7.OIOOmmoI/L的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破胞9分鐘。12000rpm離心20min,取上清進(jìn)行后面的蛋白質(zhì)純化。按每4mL上清液加入lmL50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉(zhuǎn)搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL沖洗緩沖液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑，pH8.O)到柱子里，緩慢攪拌，收集流出物。重復(fù)沖洗步驟4次。加入洗脫緩沖液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH8.O)洗脫蛋白質(zhì)。收集洗脫的蛋白質(zhì)溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有目的大小的蛋白質(zhì)條帶。6)內(nèi)切葡聚糖酶Cel5B酶活力的測定取2μI內(nèi)切葡聚糖酶Cel5B的純化物，加入250μ11OOmmoI/L的ρΗ7·O磷酸緩沖液，與250μ12%CMC溶液混合，在37°C作用10分鐘后，加入1000μIDNS溶液，放置沸水中反應(yīng)5分鐘，室溫冷卻，用分光光度計(jì)測吸光度OD53tl。吸光度測定值與不同含量的葡萄糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖作比較計(jì)算酶活。所述DNS試劑配制稱取I克NaOH用約40mLddH20溶解，再稱取I克二硝基水楊酸、O.2克苯酚、O.05克無水亞硫酸鈉、20克四水酒石酸鉀鈉，將其溶解于約30mLddH20中，兩種溶液混合，定容到100mL。內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力單位(IU)定義為每分鐘催化產(chǎn)生Iymol還原糖所需的酶量。內(nèi)切葡聚糖酶的比活力的定義每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力(U/mg)。內(nèi)切葡聚糖酶Cel5B的水解CMC比活力為28.4U/mg。權(quán)利要求1.一個來自鏈霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求I的基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。3.—種表達(dá)載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求I所述的基因。4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。5.權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)在降解纖維素的應(yīng)用。全文摘要一個鏈霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5B及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，上述基因編碼的內(nèi)切葡聚糖酶Cel5B，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示，以及該酶在分解纖維素中的應(yīng)用。文檔編號C12R1/465GK102888418SQ20121043038公開日2013年1月23日申請日期2012年11月1日優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日發(fā)明者杜麗琴,韋航,黃日波,韋宇拓,譚慧敏,雷攀先,趙英麗申請人:廣西大學(xué)