一種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白及其制備方法。本發(fā)明的二聯(lián)重組蛋白包括連接在一起的嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO1所示。本發(fā)明將嗜水氣單胞菌的II形孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分通過基因工程手段連接在一起構(gòu)建二聯(lián)重組蛋白，該蛋白免疫鰻鱺后，能同時(shí)防御嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌的感染，相比單種外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；本發(fā)明的二聯(lián)重組蛋白僅需對(duì)魚體進(jìn)行一次注射，即可獲得對(duì)多種病原菌的免疫效果，減少了對(duì)魚體的傷害，簡(jiǎn)化了免疫步驟；本發(fā)明的二聯(lián)重組蛋白的制備方法適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一兩種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近20年來，我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類出現(xiàn)暴發(fā)性敗血癥，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失，研究表明該病的主要病原菌為嗜水氣單胞菌和遲頓遲鈍愛德華氏菌。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和遲純愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是獲鱺的重要病原菌，在春夏交替時(shí)節(jié)能引起鰻鱺出血性敗血癥、肝腎腫大、爛鰓病、爛尾病等傳染性很強(qiáng)的疾病，人工養(yǎng)殖的美洲鰻鱺、歐洲鰻鱺和日本鰻鱺均可發(fā)生。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物治療該病，由于產(chǎn)生耐藥性等原因，致使可用的安全藥物越來越少。最近可見有關(guān)嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌全菌滅活苗和亞單位疫苗相關(guān)的研究，但要應(yīng)用這些研究成果對(duì)鰻鱺進(jìn)行免疫以預(yù)防多種病原菌的侵害，需要對(duì)鰻鱺進(jìn)行多次注射操作，對(duì)魚體傷害較大，且操作繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種可作為疫苗使用的鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白。
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供該二聯(lián)重組蛋白的制備方法。
[0005]本發(fā)明的一技術(shù)方案是:
[0006]一種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白，包括連接在一起的嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列分別如SEQ ID NOl的第271~544位和第1~257位所示 。
[0007]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分通過一段連接肽連接在一起，該連接肽的序列如SEQ ID NOl的第258~270為所示。
[0008]本發(fā)明的另一技術(shù)方案是:
[0009]一種編碼所述鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的基因序列，包括連接在一起的嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分的編碼核苷酸序列和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的編碼核苷酸序列，上述編碼核苷酸序列分別如SEQ ID N02的第83廣1612位和第f 771位所示。
[0010]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分的基因序列和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的基因序列通過一段如SEQ ID N02的第772~810位所示的編碼一段連接肽的核苷酸序列連接起來。
[0011]本發(fā)明的再一技術(shù)方案是:[0012]一種表達(dá)所述鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的質(zhì)粒，包括負(fù)載有SEQ ID N02所示核苷酸序列的原核表達(dá)載體。[0013]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述原核表達(dá)載體為融合表達(dá)載體。
[0014]本發(fā)明的再一技術(shù)方案是:
[0015]一種表達(dá)所述鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的大腸桿菌，該大腸桿菌轉(zhuǎn)化有負(fù)載SEQ ID N02所不核苷酸序列的原核表達(dá)載體。
[0016]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述原核表達(dá)載體為融合表達(dá)載體。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述原核表達(dá)載體為pGEX-2T_His或PGEX-4T-2。
[0018]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述用于表達(dá)的大腸桿菌為大腸桿菌BL21或大腸桿菌DH5 α。
[0019]本發(fā)明的再一技術(shù)方案是:
[0020]一種上述鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的制備方法，包括如下步驟:
[0021](I)分別擴(kuò)增編碼嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的基因序列，其氨基酸序列分別如SEQ ID NOl的第271~544位和第I~257位所示，其核苷酸序列分別如SEQ ID N02的第831~1612位和第1~771位所示；
[0022](2)將步驟(1)所得的兩個(gè)基因序列連接在一起，得到融合基因序列；
[0023](3)將步驟(2)所得的融合基因序列連接到原核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體；
[0024](4)將步驟(3)中所構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到原核宿主細(xì)胞中，并在適于表達(dá)所述融合基因的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞；
[0025](5)回收并純化所培養(yǎng)的原核宿主細(xì)胞表達(dá)的融合蛋白；
[0026](6)對(duì)步驟(5)所得的融合蛋白進(jìn)行復(fù)性。
[0027]本發(fā)明的有益效果是:
[0028]1、本發(fā)明將嗜水氣單胞菌的II形孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分通過基因工程手段連接在一起構(gòu)建二聯(lián)重組蛋白，該蛋白免疫鰻鱺后，能同時(shí)防御嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌的感染，相比單種外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；
[0029]2、本發(fā)明的二聯(lián)重組蛋白僅需對(duì)魚體進(jìn)行一次注射，即可獲得對(duì)多種病原菌的免疫效果，減少了對(duì)魚體的傷害，簡(jiǎn)化了免疫步驟；
[0030]3、本發(fā)明的二聯(lián)重組蛋白的制備方法適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖之一；
[0032]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖之二；
[0033]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0034]圖4為本發(fā)明實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖之一；
[0035]圖5為本發(fā)明實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖之二；
[0036]圖6為本發(fā)明實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖之三；
[0037]圖7為本發(fā)明實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖之四。【具體實(shí)施方式】
[0038]以下通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。
[0039]實(shí)施例1
[0040]本實(shí)施例進(jìn)行本發(fā)明的鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白。(OMP-Arom-Edwa)的制備
[0041](I)用下列特異性引物擴(kuò)增嗜水氣單胞菌的II型孔蛋白的膜外部分的核苷酸序列:正向引物BllF:
[0042]5，tcgggcggtggcggctcgggtggcggatcatccggtatcgccaagactgaatg3， (SEQ ID N03)和反向引物 BllR:5，CCGGAATTCctggatcttgtactcggtgtaggc3，(SEQ ID N04)，其中 BllF包括接頭區(qū)(tcgggcggtggcggctcgggtggcggatca), BllR包括EcoR I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基(CCGGAATTC);用下列特異性引物擴(kuò)增遲鈍愛德華氏菌的ompS2膜外部分的核苷酸序列:正向引物B79F:
[0043]CGCGGATCCgccggcctgaagtatggcaa (SEQ ID NO5)和反向引物 B79R:acccgagccaccaccgcccgagcctataagcacgggtgaagtcattctcatc (SEQ ID N06)其中 B79F 包括 BamH I 酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基(CGCGGATCC), B79R 包括接頭區(qū)(acccgagccaccaccgcccgagcctata)。
[0044]上述引物B79R和BllF的接頭區(qū)編碼的氨基酸序列為SGGGGSGGGS，精氨酸(S)與甘氨酸(G)的特點(diǎn)是柔韌性好、不易斷裂，兩個(gè)基因片段連接后，表達(dá)產(chǎn)物的柔韌性好，易曝露兩個(gè)外膜蛋白的抗原決定簇，使表達(dá)產(chǎn)物分別保持兩個(gè)外膜蛋白的免疫原性。(請(qǐng)將該段與所提供的序列表相比對(duì))
[0045]上述核苷酸序列的擴(kuò)增 條件具體如下:
[0046]
10xPili Buffer with MgSO45 μ?
dNTP Mix, 10 mMI μΕ
B79F (或 B11F )，10 mM2.5 μ?
B79R (或 BI IR )., 10 mM2.5 liL
模板 DNA B79 (或 B11 ), 50 ng/pL2 μL
Pfu DNA Polymerase0.7 \\L
超純水36.3 μΕ
[0047]PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保存。1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)。
[0048](2)將上述所得的嗜水氣單胞菌的II型孔蛋白的膜外部分的核苷酸序列和遲鈍愛德華氏菌的ompS2膜外部分的核苷酸序列連接在一起，得到融合基因序列，連接方法具體如下:
[0049]a將擴(kuò)增到的目的序列膠回收,方法同E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit使用說明書，并測(cè)定其濃度。
[0050]b采用兩步法連接上述兩個(gè)膠回收的目的序列(目的序列I和目的序列2):采用梯度PCR法確定最佳退火溫度,條件和體系如下:
[0051]第一步，PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 40s，55.3°C退火 40s，72°C延伸4min, 13個(gè)循環(huán)；4°C保存。反應(yīng)體系:
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白，其特征在于:包括連接在一起的嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列分別如SEQ ID NOl的第271~544位和第1~257位所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一種鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白，其特征在于:所述嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分通過一段連接肽連接在一起，該連接肽的序列如SEQ IDNOl的第258~270位所示。
3.一種編碼權(quán)利要求1所述的鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的基因序列，其特征在于:包括連接在一起的嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分的編碼核苷酸序列和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的編碼核苷酸序列，上述編碼核苷酸序列分別如SEQ ID N02的第831~1612位和第1-771位所示。
4.如權(quán)利要求3所述的一種編碼鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的基因序列，其特征在于:所述嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分的基因序列和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的基因序列通過一段如SEQ ID N02的第772~810位所示的編碼一段連接肽的核苷酸序列連接起來。
5.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的質(zhì)粒，其特征在于:包括負(fù)載有SEQ ID N02所示核苷酸序列的原核表達(dá)載體。
6.如權(quán)利要求5所述的一種表達(dá)鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的質(zhì)粒，其特征在于:所述原核表達(dá)載體為融合表達(dá)載體。
7.—種表達(dá)權(quán)利要求1所述的鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的大腸桿菌，其特征在于:所述大腸桿菌轉(zhuǎn)化有負(fù)載SEQ ID N02所示核苷酸序列的原核表達(dá)載體。
8.如權(quán)利要求6所述的一種表達(dá)鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的大腸桿菌，其特征在于:所述原核表達(dá)載體為融合表達(dá)載體。
9.如權(quán)利要求7或8所述的一種表達(dá)鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的大腸桿菌，其特征在于:所述用于表達(dá)的大腸桿菌為大腸桿菌BL21或大腸桿菌DH5ci。
10.一種權(quán)利要求1所述的鰻鱺嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌二聯(lián)重組蛋白的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)分別擴(kuò)增編碼嗜水氣單胞菌II型孔蛋白膜外部分和遲鈍愛德華氏菌ompS2膜外部分的基因序列，其氨基酸序列分別如SEQ ID NOl的第27廣544位和第f257位所示，其核苷酸序列分別如SEQ ID N02的第831~1612位和第1-771位所示； (2)將步驟(1)所得的兩個(gè)基因序列連接在一起，得到融合基因序列； (3)將步驟(2)所得的融合基因序列連接到原核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體； (4)將步驟(3)中所構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到原核宿主細(xì)胞中，并在適于表達(dá)所述融合基因的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞； (5)回收并純化所培養(yǎng)的原核宿主細(xì)胞表達(dá)的融合蛋白； (6 )對(duì)步驟(5 )所得的融合蛋白進(jìn)行復(fù)性。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103509120SQ201210433570
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月26日
【發(fā)明者】郭松林, 關(guān)瑞章, 王玉, 馮建軍, 林鵬, 黃文樹 申請(qǐng)人:集美大學(xué)