專利名稱：大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A發(fā)酵菌及其發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種海洋解淀粉芽孢桿菌及其發(fā)酵生產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A的優(yōu)化工藝。
背景技術(shù)：
大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin是一類24元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物，最早由Gustafson等從北太平洋980米深海洋分離到的一株海洋細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，目前該家族共有19個成員。其中Macrolactin A研究較多，其具有多種生物活性，可以抑制 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌等多種細(xì)菌，體外實驗對鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10)、HeLa腫瘤細(xì)胞、HepG2腫瘤細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒性，可有效抑制哺乳動物I型和II型單純皰疹病毒(Herpessimplex)的復(fù)制及HIV在T淋巴細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制等?，F(xiàn)有菌種產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A的效率低，產(chǎn)量少，已成為其進(jìn)行藥物開發(fā)應(yīng)用的主要瓶頸。中國期刊文獻(xiàn)，楊橋、韓文菊、張文俊等，產(chǎn)Macrolactin A抗生素海洋解淀粉芽孢桿菌的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]，藥物生物技術(shù)，2009年第4期311-315頁，公開了產(chǎn)Macrolactin A抗生素海洋解淀粉芽孢桿菌及其發(fā)酵條件優(yōu)化條件，使Macrolactin A的產(chǎn)量達(dá)到了 18. 5 μ g/ml，產(chǎn)量較低，而且其發(fā)酵周期需要7天，費(fèi)時較長，不利于后期的工業(yè)開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可大幅提高大環(huán)內(nèi)酯抗生素產(chǎn)量，提高生產(chǎn)效率的海洋解淀粉芽孢桿菌及其發(fā)酵大環(huán)內(nèi)酯抗生素的優(yōu)化工藝。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A發(fā)酵菌，該菌為ESB-2菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏編號為CGMCC No. 6554，于2012年09月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。該菌株在平板培養(yǎng)上，菌落呈圓形，淺黃色半透明，表面光滑濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，中央凸起。一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A發(fā)酵菌的發(fā)酵工藝，具體包括如下步驟(I)固體培養(yǎng)將低溫保藏的保藏編號為CGMCC No. 6554的解淀粉芽孢桿菌涂布于固體平板培養(yǎng)基上，于28. 4°C，靜置培養(yǎng)24h，其中所述的每升固體培養(yǎng)基的配制如下海水1L、蛋白胨12. 8mg、酵母粉lg、磷酸亞鐵O. Olg、瓊脂15g ；(2)種子培養(yǎng)取生長良好的平板菌種，接種于裝液量為62. 3%的種子培養(yǎng)基中，于28. 4°C，150r/mim的條件下，培養(yǎng)48h,其中所述的每升種子培養(yǎng)基的配制如下海水1L、蛋白胨12. 8mg、酵母粉lg、磷酸亞鐵O. Olg ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)取生長良好的種子液,按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于裝液量為62. 3%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28. 40C，150r/mim的條件下，培養(yǎng)48h，其中所述的每升發(fā)酵培養(yǎng)基的配制如下海水1L、蛋白胨12. 8mg、酵母粉lg、磷酸鐵O. Olg ；(4)發(fā)酵液體處理代謝產(chǎn)物的萃取取發(fā)酵液加入等體積的乙酸乙酯充分萃取一次，收集萃取液，再取萃余液加入等體積的乙酸乙酯重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取所得萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再次溶于lml90%的甲醇溶液中，12000r/min離心15min,取含大環(huán)內(nèi)酯抗生素MacrolactinA的上清液；(5) Macrolactin A 的制備 用高效液相色譜或者逆流色譜對Macrolact in A進(jìn)行分離純化，得到大環(huán)內(nèi)酯抗生素 Macrolactin A 單體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A發(fā)酵菌，該菌為ESB-2菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏編號為CGMCC No. 6554，于2012年09月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該解淀粉芽孢桿菌菌種按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于裝液量為62. 3%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28. 4°C, 150r/mim的條件下，培養(yǎng)48h,大環(huán)內(nèi)酯抗生素MacrolactinA的產(chǎn)量達(dá)到了 20. 6 μ g/ml，此產(chǎn)量超過了中國期刊文獻(xiàn)，產(chǎn)Macrolactin A抗生素海洋解淀粉芽孢桿菌的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化中報道的最高產(chǎn)量18. 5 μ g/ml，而且該菌的發(fā)酵時間只需兩天，單日發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了 10. 3 μ g/ml,大大提高了 Macrolactin A的發(fā)酵效率,對Macrolactin A的科學(xué)研究和后期的工業(yè)開發(fā)都具有重大意義。上述大環(huán)內(nèi)酯抗生素MacrolactinA發(fā)酵菌，該菌為ESB-2菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏編號為 CGMCC No. 6554，于 2012 年 09 月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。


圖I為解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜圖；圖2為Macrolactin A的核磁鑒定H譜；圖3為Macrolactin A的核磁鑒定C譜；圖4 為 Macrolactin A 結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。具體實施例一本發(fā)明一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A發(fā)酵菌，該菌為ESB-2菌株，該菌為ESB-2菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),保藏編號為CGMCC No. 6554，于2012年09月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。該菌株在平板培養(yǎng)上，菌落呈圓形，淺黃色半透明，表面光滑濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，中央凸起。該解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A的具體步驟如下( I)固體培養(yǎng)將低溫保藏的保藏號為CGMCC No. 6554的解淀粉芽孢桿菌涂布于固體平板培養(yǎng)基上，于28. 4°C，靜置培養(yǎng)24h，其中每升所述的固體培養(yǎng)基的配制如下海水1L、蛋白胨12. 8mg、酵母粉lg、磷酸亞鐵O. Olg、瓊脂15g ；(2)種子培養(yǎng)取生長良好的平板菌種，接種于裝液量為62. 3%的種子培養(yǎng)基中，于28. 4°C，150r/mim的條件下，培養(yǎng)48h,其中每升所述的種子培養(yǎng)基的配制如下海水1L、蛋白胨
12.8mg、酵母粉lg、磷酸亞鐵O. Olg ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)·取生長良好的種子液，按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于裝液量為62. 3%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于初始pH 6. 0，培養(yǎng)溫度28. 40C，150r/mim的條件下，培養(yǎng)48h，其中每升所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配制如下海水1L、蛋白胨12. 8mg、酵母粉lg、磷酸亞鐵O. Olg ；(4)發(fā)酵液體處理代謝產(chǎn)物的萃取取發(fā)酵液加入等體積的乙酸乙酯充分萃取一次，收集萃取液，再取萃余液加入等體積的乙酸乙酯重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取所得萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再次溶于lml90%的甲醇溶液中(90%甲醇溶液中溶劑是水)，12000r/min離心15min，取含大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A的上清液；(5) Macrolactin A 的制備用高效液相色譜或者逆流色譜對含大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A的上清液進(jìn)行分離純化，得到大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A單體。本發(fā)明通過Plackett-Burman實驗設(shè)計和Box-Behnken響應(yīng)面分析法對影響解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)Macrolactin A的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合核磁共振對MacrolactinA進(jìn)行定性分析以及高效液相色譜對Macrolactin A進(jìn)行定量分析，最終得到此菌株產(chǎn)Macrolactin A的最佳發(fā)酵條件為海水1L、蛋白胨12. 8mg、酵母粉lmg、磷酸亞鐵O. Olmg>初始pH 6. O、培養(yǎng)溫度28. 4°C、裝液量為62. 3%、接種量5%、培養(yǎng)時間2d。Macrolactin A定性分析對解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行大量培養(yǎng)，乙酸乙酯萃取，用大孔樹脂分離純化，得到單體化合物，進(jìn)行核磁鑒定，結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示。Macrolactin A 定量分析waters C18 反相色譜柱(18. 4 μ m, 46 X 150mm),進(jìn)樣體積10 μ L,流速O. 8mL/min,梯度洗脫，60min內(nèi)，由10%甲醇和90%水到90%甲醇和10%水,Macrolactin A 49min左右出峰,264nm波長下對色譜圖進(jìn)行積分,根據(jù)其色譜峰面積及測定的Macrolactin A的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。具體實施例二培養(yǎng)條件顯著影響因素的確定對培養(yǎng)基的蛋白胨(XI)、酵母粉(X2)、牛肉膏(X3)、葡萄糖(X4)、磷酸亞鐵(X5)、裝液量(X6)、溫度(X7)、初始pH(X8)八個因素進(jìn)行變量分析。每個變量均設(shè)定一高(+1) —低(-1)2個水平(具體數(shù)值見表I)。用minitab軟件生成8因素12次的Plackeet-Burman實驗，以大環(huán)內(nèi)酯抗生素(MacrolactinA)在264nm下的色譜峰面積作為響應(yīng)值(Y),通過minilab軟件分析各因素的效應(yīng)值，選擇影響效應(yīng)比較高的因素做進(jìn)一步考察。實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，分析結(jié)果見表3。表I培養(yǎng)基配方中各變量的水平
權(quán)利要求
1.一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A發(fā)酵菌，其特征在于該菌為ESB-2菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),保藏編號為CGMCC No. 6554,于2012年09月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的大環(huán)內(nèi)酯抗生素MacrolactinA發(fā)酵菌，其特征在于該菌株在平板培養(yǎng)上，菌落呈圓形，淺黃色半透明，表面光滑濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，中央凸起。
3.—種大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A發(fā)酵菌的發(fā)酵工藝，其特征在于具體包括如下步驟 (O固體培養(yǎng) 將低溫保藏的保藏編號為CGMCC No. 6554的解淀粉芽孢桿菌涂布于固體平板培養(yǎng)基上，于28. 4°C，靜置培養(yǎng)24h，其中所述的每升固體培養(yǎng)基的配制如下海水1L、蛋白胨·12. 8mg、酵母粉lg、磷酸亞鐵O. Olg、瓊脂15g ； (2)種子培養(yǎng) 取生長良好的平板菌種，接種于裝液量為62. 3%的種子培養(yǎng)基中，于28. 4°C,150r/mim的條件下，培養(yǎng)48h,其中所述的每升種子培養(yǎng)基的配制如下海水1L、蛋白胨12. 8mg、酵母粉lg、磷酸亞鐵O. Olg; (3)發(fā)酵培養(yǎng) 取生長良好的種子液，按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于裝液量為62. 3%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28. 40C，150r/mim的條件下，培養(yǎng)48h，其中所述的每升發(fā)酵培養(yǎng)基的配制如下海水·1L、蛋白胨12. 8mg、酵母粉lg、磷酸鐵O. Olg ； (4)發(fā)酵液體處理 代謝產(chǎn)物的萃取取發(fā)酵液加入等體積的乙酸乙酯充分萃取一次，收集萃取液，再取萃余液加入等體積的乙酸乙酯重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取所得萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再次溶于lml90%的甲醇溶液中，12000r/min離心15min,取含大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A的上清液； (5)Macrolactin A 的制備 用高效液相色譜或者逆流色譜對Macrolactin A進(jìn)行分離純化，得到大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A 單體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素Macrolactin A發(fā)酵菌及其發(fā)酵工藝，特點是該菌為ESB-2菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌，保藏編號為CGMCCNo.6554，發(fā)酵工藝具體包括將解淀粉芽孢桿菌涂布于固體平板培養(yǎng)基上，于28.4℃，培養(yǎng)24h的步驟；取生長良好的平板菌種，接種于裝液量為62.3%的種子培養(yǎng)基中，28.4℃，150r/mim培養(yǎng)48h的步驟；將種子液按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于裝液量為62.3%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28.4℃，150r/mim培養(yǎng)48h的步驟；代謝產(chǎn)物的萃取的步驟；最后對抗生素進(jìn)行分離純化，得到產(chǎn)物的步驟，優(yōu)點是可大幅提高大環(huán)內(nèi)酯抗生素產(chǎn)量，提高生產(chǎn)效率。
文檔編號C12N1/20GK102943054SQ20121043502
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者何山, 嚴(yán)小軍, 王洪強(qiáng) 申請人:寧波大學(xué)