昆蟲、昆蟲血淋巴及其組裝活性物和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術領域】，涉及昆蟲、昆蟲血淋巴及其組裝活性物在激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和To11信號傳遞途徑系統(tǒng)中的生物活性及其昆蟲、昆蟲血淋巴及其組裝活性物在微生物及其相關分子模式檢測、制備酚氧化酶原激活系統(tǒng)組裝活性物、分離純化抗菌肽中的應用。本發(fā)明還提供了一種昆蟲血淋巴收集方法及其血淋巴儲存方法與條件，在此條件下，昆蟲血淋巴的穩(wěn)定性更好，并能更好地發(fā)揮其作用。
【專利說明】昆蟲、昆蟲血淋巴及其組裝活性物和應用
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，涉及昆蟲血淋巴的收集和穩(wěn)定保存的方法及其應用。具體地說，本發(fā)明涉及對含有酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和Toll信號傳遞途徑(系統(tǒng))組成成分的昆蟲血淋巴的收集方法、針對酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和Toll信號傳遞途徑(系統(tǒng))生物活性穩(wěn)定的昆蟲血淋巴收集方法及其血淋巴儲存方法與條件、利用昆蟲及其血淋巴的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性以及Toll信號傳遞系統(tǒng)的生物活性、昆蟲血淋巴酚氧化酶原激活系統(tǒng)和Toll信號傳遞系統(tǒng)的活性成分及其重新組裝的生物活性、從昆蟲血淋巴獲得模式識別受體、級聯(lián)系統(tǒng)絲氨酸蛋白酶、酚氧化酶及其酶原、抗菌肽等生物活性物質及其生物活性進行微生物檢測。
[0002]本發(fā)明還涉及昆蟲血淋巴的生物活性、血淋巴的收集和穩(wěn)定保存的方法、體外活性組裝物的制備、以及昆蟲血淋巴及組裝活性物的應用。具體地說，本發(fā)明涉及對含有酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和Toll信號傳遞途徑(系統(tǒng))組成成分的昆蟲及其血淋巴的研究、獲得具有穩(wěn)定生物活性的酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和Toll信號傳遞途徑(系統(tǒng))的昆蟲血淋巴收集方法及其儲存方法與條件、針對昆蟲及其血淋巴的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性以及Toll信號傳遞系統(tǒng)的生物活性研究、針對昆蟲血淋巴酚氧化酶原激活系統(tǒng)和Toll信號傳遞系統(tǒng)的活性成分及其體外組裝物的生物活性研究、針對從昆蟲血淋巴獲得模式識別受體/級聯(lián)系統(tǒng)絲氨酸蛋白酶/酚氧化酶及其酶原/抗菌肽等生物活性物質及其生物活性的研究，以及上述研究在微生物檢測領域的應用。
【背景技術】:
[0003]昆蟲血淋巴是其血液和淋巴液的混合物，在昆蟲的開放式循環(huán)系統(tǒng)中循環(huán)，是昆蟲代謝的重要場所，也是代謝過程中各種物質儲存和交換的場所，在其防御、抗凍、免疫、損傷應答等方面起重要作用。
[0004]昆蟲血淋巴中含有酹氧化酶原激活系統(tǒng)(Pro-phenoloxidase activatedsystem，Pro-PO-AS)以及由酚氧化酶原激活系統(tǒng)相關的Toll信號傳遞系統(tǒng)。上述兩種免疫系統(tǒng)是昆蟲體內的重要的先天性識別和防御系統(tǒng)，在其防衛(wèi)體系中起極為重要的作用，對入侵昆蟲體內的微生物具有很強的識別與殺滅作用。酚氧化酶原激活系統(tǒng)是由各種關聯(lián)性蛋白因子構成的一個復雜的酶級聯(lián)反應系統(tǒng)，其主要成分除了酚氧化酶原(Pro-Phenoloxidase, Pro-PO)、酌.氧化酶(phenoloxidase, PO)以外，同時包括關聯(lián)性的各種模式識別蛋白、系列絲氨酸蛋白酶(原)及其相應的各種調節(jié)劑；Toll信號傳遞系統(tǒng)是由酚氧化酶原激活系統(tǒng)調控、激活的一個信號傳遞系統(tǒng)，由各種關聯(lián)蛋白因子構成了一個復雜的信號傳遞系統(tǒng)，除含有與酚氧化酶原激活系統(tǒng)共有的各種模式識別蛋白、系列絲氨酸蛋白酶(原)及其相應的各種調節(jié)劑外，亦包含抗菌肽及其誘導合成相關蛋白因子。
[0005]酚氧化酶原激活系統(tǒng)(Pro-PO-AS)通過識別微生物固有成分而被激活，隨后產生一系列具有生理活性的物質`(包括激活Toll信號傳遞系統(tǒng))，并通過多種方式參與宿主防御反應:包括提供調理素、促進血細胞吞噬作用、包囊作用、結節(jié)形成以及介導凝集和凝固、產生殺菌物質等。昆蟲體內Pro-PO-AS的末端成分之一酹氧化酶(Phenoloxidase,PO)以無活性酶原(Pro-PO)形式存在，當昆蟲受到微生物感染后，通過激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)，將Pro-PO轉變?yōu)橛谢钚缘腜O。同時，激活的酚氧化酶原激活系統(tǒng)也可激活Toll信號傳遞系統(tǒng)，誘導機體產生抗菌肽等免疫活性物質。
[0006]在酚氧化酶原激活系統(tǒng)的上游，昆蟲對病原體的識別有別于抗原與抗體的特異性結合，不是針對每一個可能的抗原，而是識別在病原體中普遍存在的高度保守的共有結構。這種識別方式被稱為模式識別作用。該作用包含兩種不可或缺的成分，病原體相關分子模式和昆蟲所具有的模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)或稱模式識別蛋白。微生物中普遍存在的高度保守的共有結構被稱為病原體相關分子模式(也稱微生物相關分子模式或簡稱相關分子模式)。已報道的病原體相關分子模式包括細菌脂多糖(LipopoIysaccharide, LPS)、妝聚糖(Peptidoglycan, PGN)、脂憐壁酸(Lipoteichoicacids, LTA)、分枝桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖、細菌DNA中未甲基化的CpG模體、RNA病毒中的雙鏈RNA和真菌的葡聚糖、甘露聚糖等。盡管這些病原體相關分子模式的化學結構極為不同，但它們具有下列共同特征:(1)由病原微生物產生；(2)屬于微生物生存所必需的保守分子模式；(3)通常為一大組微生物所共有。目前已發(fā)現的昆蟲體內模式識別蛋白，根據其與病原體相關分子模式的識別特點可分為:細菌脂多糖模式識別蛋白；肽聚糖模式識別蛋白；脂磷壁酸模式識別蛋白；真菌葡聚糖模式識別蛋白等等，上述模式識別蛋白亦可稱為微生物關聯(lián)性模式識別蛋白，簡稱關聯(lián)性模式識別蛋白和關聯(lián)性識別蛋白。
[0007]對于昆蟲體內酚氧化酶原激活系統(tǒng)、Toll信號傳遞途徑及其相關組成成分的研究始于二十世紀90年代，主要集中于果蠅、煙草天蛾、家蠶、黃粉蟲等。
[0008]在中國專利1149628A中，Ashida提出一種利用家蠶幼蟲血淋巴酚氧化酶原激活系統(tǒng)，通過對β-1，3-葡聚糖或肽聚糖含量的測定所建立的簡便、快速微生物檢測方法。該方法包括把試樣濾過一個濾膜，把濾膜上的殘留物與含有模式識別受體及酚氧化酶原激活系統(tǒng)相關活性成分的家蠶血液進行反應，根據由此引起的顏色變化檢測試樣中的微生物。在中國專利1406139Α中，Lee bok Luel等人利用黃粉蟲模式識別受體及酚氧化酶原激活系統(tǒng)檢測真菌特有病原體相關分子模式β_1，3-葡聚糖，并已申報一系列有關黃粉蟲模式識別受體和酚氧化酶原激活系統(tǒng)相關活性物質的專利。在中國專利101627052Α中，Lee bokLuel等人提供了激活黃粉蟲酚氧化酶原的新型蛋白及其編碼基因，建立使用該蛋白檢測樣品中細菌感染的方法并開發(fā)相應細菌感染檢測試劑盒。
[0009]血淋巴離體后極不穩(wěn)定，物理、化學、生物學等各種因素以及血淋巴收集方法、儲存條件等均影響并引起血淋巴內包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)在內的免疫系統(tǒng)的激活，從而導致黑化等生物反應。此時，酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號傳遞系統(tǒng)及其組分不能被充分利用與應用。同時，如果從昆蟲血淋巴中分離純化制備的酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號傳遞系統(tǒng)的活性組分、單體等，也不能充分和更好的利用與應用。
[0010]目前，國內外未見對鱗翅目(Lepidoptera)、天(大)蠶蛾科昆蟲血淋巴酹氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號傳遞系統(tǒng)等先天性防御機制的研究，因此現有血淋巴收集及儲存方法未涉及對其生物活性穩(wěn)定性的保護。本發(fā)明對酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號傳遞途徑(系統(tǒng))生物活性穩(wěn)定的昆蟲血淋巴收集及其儲存，對激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號傳遞途徑(系統(tǒng))的昆蟲血淋巴收集及其儲存等方面，進行了詳細、有效、科學的研究。
[0011]目前，國內外未見鱗翅目(Lepidoptera)、天(大)蠶蛾科昆蟲血淋巴酹氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號傳遞系統(tǒng)組成成分及其生物學活性的研究。本發(fā)明對鱗翅目(Lepidoptera)、天(大)蠶蛾科昆蟲及其血淋巴的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性以及Toll信號傳遞系統(tǒng)的生物活性、血淋巴酚氧化酶原激活系統(tǒng)的活性成分及其體外組裝的生物活性等方面進行了系統(tǒng)、有效的研究，其研究成果可應用于醫(yī)學、藥學、農學等以及醫(yī)療衛(wèi)生(臨床)、公共衛(wèi)生、生物醫(yī)藥、工業(yè)、農業(yè)、水產及其養(yǎng)殖業(yè)、動物及其養(yǎng)殖業(yè)、食品及其加工業(yè)、航天航空業(yè)等領域不同來源、不同種類、不同條件下的微生物的定性、定量或半定量檢測。

【發(fā)明內容】
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[0012]本發(fā)明提供了鱗翅目(L印idoptera)、天(大)蠶蛾科昆蟲的血淋巴、血淋巴粗提物、酚氧化酶原激活系統(tǒng)體外組裝系統(tǒng)、酚氧化酶原激活系統(tǒng)組成成分的制備方法；以及基于上述材料的微生物或其相關分子模式(包括細菌、真菌或其混合物)的檢測方法。
[0013]本發(fā)明提供了一種獲得穩(wěn)定的酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號傳遞系統(tǒng)生物活性的昆蟲血淋巴的收集方法、同時提供了血淋巴的穩(wěn)定儲存的方法。建立的方法能夠在體外有效、充分、更好的利用昆蟲血淋巴中酚氧化酶原激活系統(tǒng)及其生物活性或/和Toll信號傳遞系統(tǒng)及其生物活性。
[0014]本發(fā)明同時提供了一種激活血淋巴的收集方法，并由此獲得抗菌肽等免疫活性物質。
[0015]本發(fā)明的目的之一，是研究可獲得穩(wěn)定的酚氧化酶原激活系統(tǒng)和Toll信號傳遞系統(tǒng)的血淋巴收集方法 及其儲存方法。為血淋巴的后續(xù)應用以及酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和Toll信號傳遞系統(tǒng)的研究提供可靠的原料。
[0016]本發(fā)明的目的之二，是研究并利用昆蟲體內的酚氧化酶原激活系統(tǒng)及其生物活性和Toll信號傳遞系統(tǒng)及其生物活性的屬性，由微生物及其相關分子模式激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)，借助酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性，實現微生物的檢測。
[0017]本發(fā)明的目的之三，是研究收集所獲血淋巴的酚氧化酶原激活系統(tǒng)及其生物活性的屬性，由微生物及其相關分子模式激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)，通過酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性，實現微生物的檢測。
[0018]本發(fā)明的目的之四，是研究從血淋巴中分離純化制備酚氧化酶原激活系統(tǒng)的關聯(lián)性蛋白因子、酶(或酶原)等活性組分或/和在體外組裝具有酚氧化酶原激活系統(tǒng)生物活性的組裝活性物，利用活性組分或/和組裝活性物的生物活性，實現微生物的檢測。
[0019]本發(fā)明的目的之五，是利用上述活性物質實現的微生物檢測，在醫(yī)學、藥學、農學等以及醫(yī)療衛(wèi)生(臨床)、公共衛(wèi)生、生物醫(yī)藥、工業(yè)、農業(yè)、水產及其養(yǎng)殖業(yè)、動物及其養(yǎng)殖業(yè)、食品及其加工業(yè)、航天航空業(yè)等領域的應用。
[0020]本發(fā)明的目的之六，是利用激活昆蟲收集的血淋巴一激活血淋巴，分離純化制備抗菌肽等生物活性物質。
[0021]一、本發(fā)明相關術語說明
[0022]1.本發(fā)明所指昆蟲,是鱗翅目(Lepidoptera)、天(大)蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲。涉及天(大)蠶蛾科的昆蟲包括:昨蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度柞蠶、琥珀蠶、美國柞蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶等等。為使本專業(yè)技術人員更全面、清晰理解本發(fā)明，本發(fā)明以柞蠶為代表描述下列內容，而選擇柞蠶作為代表來描述并不是以任何方式限制本發(fā)明特批權利要求的范圍。
[0023]2.本發(fā)明選擇鱗翅目(Lepidoptera)天(大)蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲,其特征在于，是任何地域的天然或人工放養(yǎng)或人工飼養(yǎng)的昆蟲。
[0024]3.本發(fā)明所指昆蟲血淋巴(簡稱血淋巴)，是昆蟲血液(或血細胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆蟲壓榨或勻漿的體液，其特征在于，包括(I)完整、穩(wěn)定的酚氧化酶原激活系統(tǒng)及其組分；(2)受酚氧化酶原激活系統(tǒng)所調控、激活的完整、穩(wěn)定的Toll信號傳遞系統(tǒng)及其組分。
[0025]4.本發(fā)明所指酚氧化酶原激活系統(tǒng)及其生物活性，其特征在于，組成成分包括(I)酚氧化酶原；(2)針對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌的模式識別蛋白一關聯(lián)性模式識別蛋白；(3)酚氧化酶原激活系統(tǒng)關聯(lián)的系列絲氨酸蛋白酶(原)；(4)酚氧化酶原激活系統(tǒng)關聯(lián)的調控因子。酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性的表現是酚氧化酶原被激活成酚氧化酶或/和激活.Toll信號傳遞系統(tǒng)。Toll信號傳遞系統(tǒng)的組分是各種關聯(lián)性調控因子，其生物活性的特征是抗菌肽等生物活性物質的誘導產生。
[0026]5.本發(fā)明所指檢測的微生物樣品，其特征在于，包括(I)微生物(活微生物或死微生物)，(2)微生物相關分子模式，(3)樣品來源于醫(yī)學、藥學、農學等以及醫(yī)療衛(wèi)生(臨床)、公共衛(wèi)生、生物醫(yī)藥、工業(yè)、農業(yè)、水產及其養(yǎng)殖業(yè)、動物及其養(yǎng)殖業(yè)、食品及其加工業(yè)、航天航空業(yè)等領域。
[0027]6.本發(fā)明所指組 裝活性物，其特征在于，包括(I)通過分離純化技術去除血淋巴中與酚氧化酶原激活系統(tǒng)生物活性無關的一些組分一雜質；(2)通過分離純化技術去除血淋巴中抑制酚氧化酶原激活系統(tǒng)生物活性的組分；(3)酚氧化酶原激活系統(tǒng)相關組成成分的體外組裝；(4)上述任何一類組裝活性物均具有酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性。
[0028]7.本發(fā)明所指血淋巴的生物活性檢測，是針對血淋巴的酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和Toll信號傳遞途徑系統(tǒng)被激活，利用本發(fā)明所述的微生物感染(或激活)昆蟲或微生物模式分子激活昆蟲的激活方式、方法等激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和Toll信號傳遞途徑系統(tǒng)。通過檢測激活的酚氧化酶的活性或/和抗菌肽誘導產生量來實現。酚氧化酶的活性是通過酚氧化酶能夠使酚類化合物氧化成醌化合物以及進一步氧化，使血淋巴發(fā)生黑化及其程度實現檢測。檢測體系的溫度在10°C -60°C，優(yōu)選25°C -45°C。檢測體系的酸堿度在pH2-pH13，優(yōu)選 pH5-pH9。
[0029]8.本發(fā)明所指感染(或激活)昆蟲(簡稱激活昆蟲)，其特征在于，(I)將劑量和種類不限的微生物或其相關分子模式注入昆蟲體內，從注入直至昆蟲死亡的任何時間節(jié)點的昆蟲；(2)昆蟲體黑化乃至死亡，同時，體內有誘導的抗菌肽產生，(3)細菌或真菌可以是活菌或死菌。
[0030]9.本發(fā)明所指激活昆蟲血淋巴，其特征在于，從上述激活昆蟲中獲得的血淋巴，血淋巴的酚氧化酶原激活系統(tǒng)和Toll信號傳遞系統(tǒng)的組分處于被激活狀態(tài)，同時含有被誘導產生的抗菌肽等一些生物活性物質。
[0031]本發(fā)明通過如下基本程序、原則、條件、要求、方法等實現。如下陳述，是使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權利要求的范圍。
[0032]二、本發(fā)明是通過如下技術方案實現的:
[0033](一)昆蟲血淋巴酚氧化酶原系統(tǒng)的生物活性
[0034]1.昆蟲體內血淋巴酚氧化酶原激活系統(tǒng)對微生物感染的響應
[0035]本發(fā)明將革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌以及三類微生物的分子模式一肽聚糖、甘露聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、β-1，3-葡聚糖分別或同時注入活的昆蟲體內后，觀察昆蟲體表的黑化程度或及昆蟲死亡狀況。由于昆蟲體內存在完整的酚氧化酶原激活系統(tǒng)，因此注入到昆蟲體內的微生物可通過激活該系統(tǒng)最終引起酚氧化酶原的活化。有活性的酚氧化酶導致黑色素的產生，引起昆蟲體表出現黑化現象。黑化程度可反映黑色素的產生量，后者反映出酚氧化酶的活性，進而反映出酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活程度，乃至微生物或其相關分子模式的劑量，大劑量微生物或其相關分子模式可以使昆蟲死亡。
[0036]基于本發(fā)明可利用昆蟲實現對微生物和/或微生物相關分子模式的檢測。將待檢樣品以及空白對照、陽性對照分別注射入昆蟲體內，其中，空白對照組的昆蟲及其體表正常；陽性對照組則使昆蟲體表黑化乃至死亡。待檢樣品組的昆蟲體表，如果與空白對照組的一樣，表明樣品中不含微生物或其相關分子模式，或樣品中所含微量微生物或其相關分子模式的劑量，不足引發(fā)昆蟲體表黑化；待檢樣品組的昆蟲體表發(fā)生了黑化乃至死亡，則表明樣品含有微生物或其相關分子模式，通過與陽性對照組比較可進行半定量分析。
[0037]本發(fā)明中所指微生物及其相關分子模式、昆蟲的特征如前所述。
[0038]2.體外血淋 巴酚氧化酶原激活系統(tǒng)對微生物及其相關分子模式的響應
[0039]本發(fā)明將革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌以及相應的分子模式一肽聚糖、甘露聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、β -1,3-葡聚糖分別或同時與昆蟲血淋巴收集液混合，以生理鹽水作空白對照。保溫一定時間后，進行溶液顏色(黑化)的比較或比色分析。由于血淋巴收集液含有完整、穩(wěn)定的酚氧化酶原激活系統(tǒng)，因此微生物或其相關分子模式可激活該系統(tǒng)，引起酚氧化酶原的活化。酚氧化酶的活性與微生物或其相關分子模式的含量呈正比。
[0040]本發(fā)明通過顏色反應測定酚氧化酶的活性，所采用的底物為多巴或多巴胺或4-羥基脯氨酸乙酯鹽與4-甲基兒茶酚混合物。酚氧化酶可將多巴或多巴胺轉變?yōu)楹谏?如圖1(A)所示)，肉眼可見顏色變化，且其顏色深淺與酚氧化酶活力呈正比，檢測波長為490nm±50nm(優(yōu)選490nm± IOnm)。酹氧化酶可將4-羥基脯氨酸乙酯鹽與4-甲基兒茶酹混合物轉變?yōu)橛猩a物(如圖1 (B)所示)，肉眼可見顏色變化，且其顏色深淺與酚氧化酶活力呈正比，檢測波長是520nm+50nm(優(yōu)選520nm±10nm)。因此，通過建立已知劑量的微生物或其相關分子模式與顏色深淺之間的標準曲線，可實現對待檢樣品組的微生物或其相關分子模式的定性或半定量或定量分析。
[0041]本發(fā)明所使用的昆蟲血淋巴收集液，是按發(fā)明所述方法、技術、條件等獲得昆蟲血淋巴收集液。本發(fā)明中所指微生物及其相關分子模式特征如前所述。
[0042]( 二)酚氧化酶原激活系統(tǒng)組裝活性物的制備及其生物活性
[0043]本發(fā)明所指組裝活性物，其特征在于，包括(I)通過分離純化技術去除血淋巴中與酚氧化酶原激活系統(tǒng)生物活性無關的一些組分一雜質；(2)通過分離純化技術去除血淋巴中抑制酚氧化酶原激活系統(tǒng)生物活性的組分；(3)酚氧化酶原激活系統(tǒng)相關組成成分的體外組裝；(4)上述任何一類組裝活性物均具有酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性。[0044]本發(fā)明所指從昆蟲血淋巴收集液中分離純化酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組分的條件特征包括:(I)操作溫度在0°C -45°C，優(yōu)選0°C -1O0C ； (2)溶液的酸堿度在pH2_pH12，優(yōu)選pH4-pH10 ; (3)調節(jié)溶液酸堿度的化學試劑是常規(guī)、通用的酸或堿及其溶液，酸及其溶液優(yōu)選HCl、HAc、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸，堿及其溶液優(yōu)選Na0H、K0H、Tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂；(4)緩沖液是常規(guī)、通用緩沖離子對緩沖液，優(yōu)選檸檬酸根緩沖離子對、HCl-Tris緩沖離子對、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對、磷酸根緩沖離子對、醋酸根緩沖離子對、硼酸根緩沖離子對、硼酸-Tris緩沖離子對、上述各緩沖離子的組合；5.溶液或緩沖液的離子強度在0.001mol/L-0.5mol/L,優(yōu)選0.01mol/L-0.lmol/L。上述條件不影響酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組分的生物活性。
[0045]從昆蟲血淋巴收集液分離純化酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組分的技術特征，是采用鹽析或離子交換層析或疏水作用層析或凝膠過濾或不同技術方法的組合。
[0046](三)昆蟲血淋巴的收集及儲存方法
[0047]本發(fā)明可采用常規(guī)方法，如蠟盤法、離心法、背血管取血法、灌注法、壓榨、勻漿法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪開法、穿刺法等，在10°c至-5°c條件下收集昆蟲血淋巴。
[0048]為確保獲得具有酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號傳遞系統(tǒng)生物活性的穩(wěn)定的昆蟲血淋巴，其收集及儲存過程需要同時滿足如下條件:(I)收集過程使用的器械、溶液、容器等均處無菌狀態(tài)，且不含有微生物相關分子模式；(2)收集后的血淋巴需放置于中性鹽溶液、或含有酚氧化酶原激活系統(tǒng)抑制劑的溶液、或含抗凝劑的溶液、或直接收集至液氮或干冰，以及上述條件的任何組合。
[0049]上述說明所指中性鹽選自硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉；中性鹽溶液的飽和度在10% -90% ;溫度在15°C至零下5°C，優(yōu)選(TC _4°C。
[0050]上述說明所指收集所用溶液，選自蒸餾水、無離子水、生理鹽水(常規(guī)、通用生理鹽水)、昆蟲生理鹽水(常規(guī)、通用昆蟲生理鹽水)、緩沖液(常規(guī)、通用緩沖離子對所組成的緩沖液)。所述緩沖液的緩沖離子對優(yōu)選檸檬酸根緩沖離子對、HCl-Tris緩沖離子對、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對、磷酸根緩沖離子對、醋酸根緩沖離子對、硼酸根緩沖離子對、硼酸-Tris緩沖離子對以及上述各緩沖離子的組合；緩沖液的離子強度在0.0Olmol/L-lmol/L,優(yōu)選 0.01mol/L-0.5mol/L。
[0051]在收集用溶液中還可加入二價金屬離子螯合劑，優(yōu)選EDTA或TDTA等，二價金屬離子螯合劑的優(yōu)選濃度在0.01mmol/L-100mmol/Lo
[0052]在收集用溶液中還可加入酚氧化酶原激活系統(tǒng)抑制劑，優(yōu)選苯甲脒或PMSF(苯甲基磺酸氟化物)或蔗糖或DFP(二異丙基氟磷酸)或苯甲脒、苯甲基磺酸氟化物、二異丙基氟磷酸、鹿糖的任何組合，抑制劑濃度優(yōu)選0.lmmol/L-30mmol/Lo
[0053]收集用溶液酸堿度在pH2_pH13，優(yōu)選pH4_pH9。
[0054]收集用的溶液是無菌并且不含任何微生物相關分子模式。
`[0055]上述說明所指抗凝劑，至少包含下列抗凝成分中的一種或其任何組合:(I)肝素，濃度為0.01mg/ml-10mg/ml,優(yōu)選0.05mg/ml-lmg/ml ； (2)水溶性檸檬酸鹽，濃度為0.001mol/L-0.5mol/L,優(yōu)選 0.01mol/L-0.5mol/L ； (3)水溶性草酸鹽，濃度為 0.01mg/ml-10mg/ml，優(yōu)選 0.05mg/ml-lmg/ml。
[0056]本發(fā)明獲得的血淋巴以及建立的血淋巴收集和儲存方法可以在生物醫(yī)藥業(yè)、工業(yè)、農業(yè)、水產及其養(yǎng)殖業(yè)、航天航空業(yè)、食品加工業(yè)等領域廣泛應用。
[0057](四)激活昆蟲血淋巴的制備及活性物質的獲得
[0058]1.激活血淋巴的制備與儲存
[0059]取鱗翅目、天蠶蛾科昆蟲幼蟲，按照微生物感染(或激活)昆蟲的方法及其特征等要求激活。激活方法的特征在于，(I)將劑量不限的革蘭陽性菌或革蘭陰性菌或真菌注入昆蟲體內，從注入直至昆蟲死亡的任何時間節(jié)點的昆蟲，⑵將劑量與比例不限的革蘭陽性菌與革蘭陰性菌混合物或革蘭陽性菌與真菌混合物或革蘭陽性菌與真菌混合物注入昆蟲體內，從注入直至昆蟲死亡的任何時間節(jié)點的昆蟲，⑶將劑量與比例不限的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌混合物注入昆蟲體內，從注入直至昆蟲死亡的任何時間節(jié)點的昆蟲，(4)昆蟲體黑化乃至死亡，同時，體內有誘導的抗菌肽產生，(5)革蘭陽性菌或革蘭陰性菌或真菌可以是活菌或死菌。
[0060]取鱗翅目、天蠶蛾科昆蟲，按照微生物相關模式分子激活昆蟲的方法及其特征等要求激活。激活方法的特征在于，(I)將劑量不限的革蘭陽性菌模式分子或革蘭陰性菌模式分子或真菌模式分子注入昆蟲體內，從注入直至昆蟲死亡的任何時間節(jié)點的昆蟲，(2)將劑量與比例不限的革蘭陽性菌模式分子與革蘭陰性菌模式分子混合物或革蘭陽性菌模式分子與真菌模式分子混合物或革蘭陽性菌模式分子與真菌模式分子混合物注入昆蟲體內，從注入直至昆蟲死亡的任何時間節(jié)點的昆蟲，(3)將劑量與比例不限的革蘭陽性菌模式分子、革蘭陰性菌模式分子和真菌模式分子混合物混合物注入昆蟲體內，從注入直至昆蟲死亡的任何時間節(jié)點的昆蟲，(4)昆蟲體黑化乃至死亡，同時，體內有誘導的抗菌肽產生。
[0061]2.抗菌肽等生物活性物質的分離與純化
[0062]從激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征:1.操作溫度在0°c-100°c ；2.溶液的酸堿度在PH2-PH12，優(yōu)選PH4-PH10 ;3.調節(jié)溶液酸堿度的化學試劑是常規(guī)、通用的酸或堿及其溶液，酸及其溶液優(yōu)選HC1、HAc、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸，堿及其溶液優(yōu)選NaOH、KOH、Tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂；4.緩沖液是常規(guī)、通用緩沖離子對緩沖液，優(yōu)選檸檬酸根緩沖離子對、HCl-Tris緩沖離子對、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對、磷酸根緩沖離子對、醋酸根緩沖離子對、硼酸根緩沖離子對、硼酸-Tris緩沖離子對、上述各緩沖離子的組合；5.溶液或緩沖液的離子強度在0.0Olmol/L-0.5mol/L,優(yōu)選 0.01mol/L-0.lmol/L。
[0063]從激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽的技術特征，是將血淋巴經加熱、沉淀去除部分雜蛋白后，采用鹽析或離子交換層析或疏水作用層析或凝膠過濾或上述技術的任何組合。
[0064](I)離子交換層析分離純化抗菌肽等生物活性物質
[0065]取激活昆蟲血淋巴收集液，加熱、沉淀去除部分雜蛋白后按激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征要求，用酸性溶液或堿性溶液調PH至要求條件范圍下。將處理好的樣品上樣于預先用緩沖液平衡好的離子交換層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。沉脫方式，可以采用鹽濃度階段方式，分別用0.lmol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、lmol/L、2mol/L、3mol/L鹽溶液進行階段洗脫；也可以米用鹽濃度梯度方式，梯度從0.00mOl/L -3mOl/L。利用常規(guī)、通用的抗菌生物活性實驗檢測跟蹤抗菌肽等生物活性組分，或利用抗菌肽抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有抗菌肽等生物活性組分的洗脫液合并儲存?zhèn)溆?。如果需要，可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽，或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
[0066]離子交換層析分離純化的特征:1.層析介質選擇陽離子交換層析添料，如CM-離子交換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料等陽離子交換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在PH2-PH7 ；2.層析介質選擇陰離子交換層析添料，如Q-離子交換層析添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料等離子交換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12 ；3.洗脫的鹽溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；4.中性鹽選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，優(yōu)選NaCl。
[0067](2)疏水層析分離純化抗菌肽等生物活性物質
[0068]取激活昆蟲血淋巴收集液，加熱、沉淀去除部分雜蛋白后按激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征要求，用酸性溶液或堿性溶液調PH至要求條件范圍下。加中性鹽至2mol/L濃度，上樣于預先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用中性鹽濃度梯度(2.0mol/L~0.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽濃度階段洗脫方式，分別采用15mol/L、l.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2中性鹽溶液進行階段方式洗脫。利用常規(guī)、通用的抗菌生物活性實驗檢測跟蹤抗菌肽等生物活性組分，或利用抗菌肽抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有抗菌肽等生物活性組分的洗脫液合并儲存?zhèn)溆谩Ｈ绻枰?，可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽，或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
[0069]疏水層析分離純化的特征:1.疏水層析介質選擇苯基-疏水層析添料或正辛烷-疏水層析添料-或己烷-疏水層析添料-或丁烷-疏水層析添料；2.中性鹽選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl ；3.分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按從激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征所描述的特征。
[0070](3)凝膠層析分離純化抗菌肽等生物活性物質
[0071]取激活昆蟲血淋巴收集液`，加熱、沉淀去除部分雜蛋白后按激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征要求，用酸性溶液或堿性溶液調PH至要求條件范圍下。樣品液上樣于預先用緩沖液平衡好的凝膠過濾層析柱并進行分離純化洗脫，利用常規(guī)、通用的抗菌生物活性實驗檢測跟蹤抗菌肽等生物活性組分，或利用抗菌肽抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有抗菌肽等生物活性組分的洗脫液合并儲存?zhèn)溆谩Ｈ绻枰?，可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽，或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
[0072]凝膠層析分離純化的特征:1.層析介質可以選擇Sephacryl S-100 HR或Sephacryl S_200 HR或Sephadex G-50 或Sephadex G-75 或Sephadex G-100 或SephadexG-150 或 Superose 12 prep grade 或 Superose 6 prep grade 或 Superdex 30 prep grade或 Superdex 75 prep grade 或 Superose 12 HR 或 Superose 6 HR 或 Superdex PeptideHR或Superdex 75 HR或Superdex Peptide PE等凝膠層析添料；2.分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按從激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征所描述的特征，此外洗脫液的濃度，優(yōu)選在離子濃度大于0.15M及以上。
[0073](4)鹽析分離純化抗菌肽等生物活性物質[0074]取激活昆蟲血淋巴收集液，加熱、沉淀去除部分雜蛋白后按激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征要求，用酸性溶液或堿性溶液調PH至要求條件范圍下。在樣品溶液中加入蛋白質鹽析常規(guī)、通用的中性鹽，至濃度達到抗菌肽仍處于溶解狀態(tài)，而一些雜蛋白處于沉淀。離心取其上清溶液繼續(xù)加入鹽析常規(guī)、通用的中性鹽至濃度達到抗菌肽沉淀狀態(tài)。離心棄上清，沉淀溶于從激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征的溶液或緩沖液儲存?zhèn)溆?；沉淀的溶解液，也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去其中的鹽或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
[0075]鹽析分離純化的特征:1.分離純化的緩沖液、酸堿度選擇，是按從激活昆蟲血淋巴收集液分離純化抗菌肽等生物活性物質的條件特征所描述的特征；2.分離純化操作溫度在0°C -45°C，優(yōu)選0°C ；3.鹽析使用的中性鹽，選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，優(yōu)選(NH4)2SO4或Na2SO4 ;4.在使抗菌肽等生物活性物質處于溶解狀態(tài)，選擇中性鹽在15%-65%，優(yōu)選30%-50% ；5.在使抗菌肽等生物活性物質處于鹽析沉淀狀態(tài)，選擇中性鹽在 60% -90%，優(yōu)選 70% -85%。
[0076]上述方法獲得制備的抗菌肽等生物活性物質，依其生物活性應用于醫(yī)學、藥學、農學等以及醫(yī)療衛(wèi)生(臨床)、公共衛(wèi)生、生物醫(yī)藥、工業(yè)、農業(yè)、水產及其養(yǎng)殖業(yè)、動物及其養(yǎng)殖業(yè)、食品及其加工業(yè)、航天航空業(yè)等領域。
[0077]為有效獲得高純度抗菌肽，可進一步將上述四種分離純化方法(離子交換柱層析、疏水柱層析、凝膠過濾柱層析、鹽析)，進行兩種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或三種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或四種分離純化方法自由組合及其順序重排組合。
[0078]上述方法獲得制備的高純度抗菌肽等生物活性物質，依其生物活性應用于醫(yī)學、藥學、農學等以及醫(yī)療衛(wèi)生(臨床)、公共衛(wèi)生、生物醫(yī)藥工業(yè)、農業(yè)、水產及其養(yǎng)殖業(yè)、動物及其養(yǎng)殖業(yè)、食品及其加工業(yè)、航天航空業(yè)等領域。如，獲得電泳純或HPLC純的抗菌肽，可以利用蛋白質活性、分子生物學等技術、方法，解析抗菌肽的結構并可從昆蟲獲得抗菌肽基因，利用基因工程技術表達抗菌肽。此抗菌肽可以進一步研究開發(fā)生物技術藥物，或作為抗菌活性物質而應用于各個領域。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0079]圖1為昆蟲血淋巴樣品激活后的顏色反應；
[0080]圖2為血淋巴收集及儲存方法的穩(wěn)定性；
[0081]圖3為微生物及相關分子模式一肽聚糖使柞蠶幼蟲體表發(fā)生黑化，
[0082]A.柞蠶幼蟲；B.大腸桿菌致黑化；C.金黃色葡萄球菌致黑化；D白色念珠菌致黑化；E肽聚糖致黑化；F: β -1，3-葡聚糖致黑化；G:脂多糖致黑化；H:脂磷壁酸致黑化
[0083]圖4為微生物相關分子模式體外對血淋巴的激活作用，
[0084]1:陰性對照；2:脂多糖；3:肽聚糖；4:脂磷壁酸；5: β -1,3-葡聚糖；6:甘露聚糖；7:脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸的混合物；8: β -1,3-葡聚糖與甘露聚糖的混合物；9:月旨多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖與β-1，3-葡聚糖的混合物；
[0085]圖5為微生物體外對血淋巴的激活作用，[0086]1:大腸桿菌混懸液；2:金黃色葡萄球菌混懸液；3:弗氏志賀氏菌混懸液；4:粘質沙雷氏菌混懸液；5:枯草芽孢桿菌混懸液；6:白色念珠菌混懸液；7:酵母菌混懸液；8:黑曲霉混懸液；9:白地霉混懸液；
[0087]圖6中性鹽分級鹽析制備酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組合物，
[0088]I:陽性對照 2:40、60及 80的混合物；3:20*%樣品；4:40*%樣品；5:60*%樣品；6:80*%樣品；
[0089]圖7為離子交換層析法制備酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組合物，
[0090]A:離子交換層析圖譜；B:組合物活性檢測結果
[0091 ] 1:組分I ;2:組分2 ;3:組分3 ；4:組分I，2混合物；5:組分2，3混合物；6:組分I，3混合物；7:組分1，2，3混合物；
[0092]圖8疏水層析分離純化制備酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組合物，
[0093]A:疏水層析圖譜；B:組合物活性檢測結果
[0094]1.組分1，3，4，5混合物；2:組分I ;3:組分2 ；4:組分3 ；5:組分4 ；6:組分5 ；
[0095]圖9凝膠層析分離純化制備酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組合物，
[0096]A:凝膠層析圖譜；B:組合物活性檢測結果
[0097]1.組分1,2,3混`合物；2:組分I ；3:組分2 ；4:組分3 ；
[0098]圖10蛋白免疫印跡法檢測血淋巴中抗菌肽生成量，
[0099]A昆蟲抗菌肽樣品；B.未激活的昆蟲血淋巴樣品；C激活的昆蟲血淋巴樣品。
【具體實施方式】:
[0100]實施例1
[0101]血淋巴的收集與儲存方法
[0102]本實施例使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權利要求的范圍。
[0103]用無菌水(蒸餾水或去離子水)，采用淋洗的方法反復清洗昆蟲3-4次；清洗后晾干體表液體后采用75%酒精進行體表消毒。將昆蟲置于冰浴中麻醉直至反應遲鈍。按下列不同條件分別收集并儲存血淋巴:
[0104](I)采用灌注法，將抗凝緩沖溶液(15mmol.T1NaCl ；136mmol.L—1檸檬酸鈉;26mmol.L—1檸檬酸；20mmol.L^1EDTA, pH4.0)預先注射進昆蟲幼蟲的體腔，移除昆蟲的后足或撕開昆蟲腹部收集血淋巴?；靹蚝骭80°C儲存待用。
[0105](2)采用撕裂法，既用滅菌后的剪子使昆蟲幼蟲形成開放性傷口，將昆蟲傷口朝下置于離心管管口，將血淋巴直接擠壓至離心管內。離心管內預先放置抗凝緩沖溶液(15mmol.L 1NaCl ； 136mmol.L 1 梓樣酸納;26mmol.L 1 梓樣酸;20mmol.L 1EDTA, pH5.0)，收集血淋巴，混勻后離心收集上清液(血漿)，干冰儲存待用。
[0106](3)采用勻漿法，將昆蟲成蟲放入預先滅菌的組織勻漿器內，加入含有5mmol/L苯甲脈的昆蟲生理鹽水(130mmol.L 1NaCl ；5mmol.L 1KClL 1CaCl2, pH6.5)，勻衆(zhòng)后離心取上清液，無菌條件下冷凍干燥，-80°C儲存待用。
[0107](4)采用壓榨法，將昆蟲蛹放入離心管內，壓碎昆蟲，再通過微孔濾膜過濾除菌，將收集所獲血淋巴中加入固體硫酸銨至飽和度80%，混勻后_20°C儲存待用。[0108](5)采用撕裂法，既用滅菌后的剪子使昆蟲幼蟲形成開放性傷口，將昆蟲傷口朝下置于含液氮的樣品管管口，將血淋巴擠壓至樣品管內。放置于液氮中保存待用。
[0109](6)采用灌注法，用注射器將含有5mmol/L苯甲脒的抗凝緩沖溶液(15mm0l.L 1NaCl ； 136mmol.L 1 梓樣酸納;26mmol.L 1 朽1 樣酸;20mmol.L 1EDTA, pH6.0)，注射進昆蟲幼蟲的體腔，移除昆蟲的后足或撕開昆蟲腹部收集血淋巴?；靹蚝蠓庞诟杀袃Υ娲?。
[0110]考察上述方法收集所獲血淋巴中酚氧化酶的活力，結果如圖2-A所示，比較加入真菌分子模式一 β-1，3-葡聚糖前(一)后(+)血淋巴酚氧化酶的活性。試驗結果顯示，在含有β_1，3-葡聚糖的條件下，采用上述六種方法獲得的血淋巴顯示了很高的酚氧化酶活性(1-6號樣品)，反之，則酚氧化酶的活性很低。采用常規(guī)方法收集的血淋巴(7號樣品)在加入β_1，3-葡聚糖前(一)后(+)則無明顯差別，酚氧化酶均顯示出較高活性，說明常規(guī)方法收集的血淋巴不穩(wěn)定，已被部分或完全激活。1-6號血淋巴在放置12個月后，再次測定其酚氧化酶活力。試驗結果如圖2-Β所示，酚氧化酶原激活系統(tǒng)的穩(wěn)定性無明顯變化。上述試驗說明，本實施例所描述的六種血淋巴收集及儲存方法均可保證血淋巴中酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性及其穩(wěn)定性，滿足本發(fā)明對血淋巴收集及儲存的要求。
[0111]實施例2
[0112]昆蟲體內血淋巴酚氧化酶原激活系統(tǒng)對微生物感染的響應
[0113]利用昆蟲檢測微生物的基本程序、原則、條件、要求、方法等及其特征，以鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲的代表一昨蠶為原料進行試驗。
[0114]取八組柞蠶幼蟲，每組10只。將大腸桿菌(革蘭陰性菌)混懸液、金黃色葡萄球菌(革蘭陽性菌)混懸液、白色念珠菌(真菌)混懸液、肽聚糖溶液、β -1，3-葡聚糖溶液、脂多糖溶液、脂磷壁酸溶液分`別注入柞蠶幼蟲體內，以生理鹽水作空白對照，觀察柞蠶幼蟲體表的顏色變化狀況。
[0115]結果如圖3所示，樣品組均使柞蠶幼蟲體表發(fā)生黑化以及死亡；而空白對照的柞蠶幼蟲體表沒有發(fā)生黑化與死亡。表明微生物及其相關分子模式能夠激活柞蠶體內的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性，并使柞蠶發(fā)生黑化以及死亡。
[0116]上述試驗表明，利用昆蟲，針對微生物或及相關分子模式，能夠檢測樣品是否還有微生物或被微生物感染(污染)。這種模式應用于醫(yī)學、藥學、農學等以及醫(yī)療衛(wèi)生(臨床)、公共衛(wèi)生、生物醫(yī)藥、工業(yè)、農業(yè)、水產及其養(yǎng)殖業(yè)、動物及其養(yǎng)殖業(yè)、食品及其加工業(yè)、航天航空業(yè)等領域和上述領域的環(huán)境微生物檢測、監(jiān)控等。
[0117]實施例3
[0118]微生物相關分子模式體外對血淋巴酚氧化酶原的激活作用
[0119]利用昆蟲淋巴收集液檢測微生物相關分子模式的基本程序、原則、條件、要求、方法等及其特征，以鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲的代表一昨蠶作為原料進行試驗。
[0120]分別或同時將微生物相關分子模式一脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖、脂磷壁酸和β -1，3-葡聚糖與昆蟲血淋巴收集液混合，生理鹽水作空白對照。25°C、pH5條件下保溫后，以多巴為檢測底物，測定490nm吸收值，考察微生物相關分子模式對血淋巴收集液中酚氧化酶活力的影響。
[0121]實驗結果如圖4所示，實驗組(柱狀圖2-9)中的昆蟲血淋巴收集液發(fā)生黑化作用；而空白對照(柱狀圖1)則沒有發(fā)生黑化作用。表明不同類型的微生物相關分子模式及其組合均能夠激活昆蟲血淋巴收集液的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性，并使昆蟲血淋巴收集液發(fā)生黑化作用。據此檢測樣品是否含有微生物或被微生物感染(污染)。
[0122]實施例4
[0123]微生物體外對血淋巴酚氧化酶原的激活作用
[0124]利用昆蟲淋巴收集液檢測微生物的基本程序、原則、條件、要求、方法等及其特征，以鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲的代表一昨蠶作為原料進行試驗。
[0125]本發(fā)明將不同類型的革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌既大腸桿菌混懸液、金黃色葡萄球菌混懸液、弗氏志賀氏菌混懸液、粘質沙雷氏菌混懸液、枯草芽孢桿菌混懸液、白色念珠菌混懸液、酵母菌混懸液、黑曲霉混懸液、白地霉混懸液分別與昆蟲血淋巴收集液混合，以微生物混懸液的溶劑一生理鹽水作空白對照。30°C、pH8.0保溫后，以4-羥基脯氨酸乙酯鹽與4-甲基兒茶酚混合物為底物，檢測520nm吸收值，考察微生物對血淋巴收集液中酚氧化酶活力的影響。
[0126]實驗結果如圖5所示，實驗組(柱狀圖2-9)使昆蟲血淋巴收集液中的酚氧化酶原被激活；而空白對照(柱狀圖1)則沒有發(fā)生變化。表明不同類型的微生物均能夠激活昆蟲血淋巴收集液的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的生物活性,并使昆蟲血淋巴收集液呈現出較高的酚氧化酶活性。據此檢測樣品是否含有微生物或被微生物感染(污染)。
[0127]實施例5
[0128]血淋巴對不同微生物的檢測靈敏度
[0129]利用昆蟲淋巴收集液檢測微生物的基本程序、原則、條件、要求、方法等及其特征，以鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲的代表一昨蠶為原料進行試驗。
[0130]本實施例采用實施例1中方法1-6分別收集獲得的血淋巴對包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產氣腸桿菌、弗氏志賀氏菌、粘質沙雷氏菌、枯草芽孢桿菌在內的兩種革蘭陽性菌和四種革蘭陰性菌進行檢測，檢測結果以4-羥基脯氨酸乙酯鹽與4-甲基兒茶酚混合物的呈色現象表示，每組實驗重復30次。實驗結果如表1所示，六種不同收集方法所獲得的血淋巴對上述六種細菌均可檢出。
[0131]表1血淋巴對細菌的檢測
[0132]
【權利要求】
1.昆蟲、昆蟲血淋巴及其組裝活性物在激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)或/和Toll信號傳遞途徑系統(tǒng)中的生物活性。
2.昆蟲、昆蟲血淋巴及其組裝活性物在微生物及其相關分子模式檢測中的應用。
3.昆蟲血淋巴在制備酚氧化酶原激活系統(tǒng)組裝活性物中的應用。
4.昆蟲血淋巴在分離純化抗菌肽中的應用。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的應用，其特征在于，所述的昆蟲血淋巴含有酚氧化酶原激活系統(tǒng)組分，酚氧化酶原激活系統(tǒng)組分包括針對革蘭陽性菌或革蘭陰性菌或真菌的模式識別蛋白一關聯(lián)性模式識別蛋白、系列關聯(lián)性絲氨酸蛋白酶(原)、相應的各種關聯(lián)性調節(jié)劑、酚氧化酶原，酚氧化酶原激活系統(tǒng)通過識別微生物或相關分子模式，激活下游絲氨酸蛋白酶級聯(lián)系統(tǒng)，最終導致酚氧化酶原被激活成酚氧化酶或/和激活Toll信號傳遞系統(tǒng)，從而誘導產生抗菌肽。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，制備酚氧化酶原激活系統(tǒng)組裝活性物采用中性鹽分級鹽析方法、離子交換層析方法、疏水層析方法、凝膠過濾層析方法制備。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于: 中性鹽分級鹽析方法的步驟如下: 將昆蟲血淋巴收集液,按從昆蟲血淋巴收集液分離純化酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組分技術的特征要求，用酸性溶液或堿性溶液調PH至要求條件范圍內并置于特征要求的溫度，優(yōu)選0°C -1O0C ;在樣品溶液中加入中性鹽至飽和度20%，中性鹽完全溶解后放置一段時間，低溫離心后，分別收集沉淀和上清液，沉淀保存?zhèn)溆?，上清液繼續(xù)加入中性鹽至飽和度，40%，中性鹽完全溶解后放置一段時間，低溫離心后，分別收集沉淀和上清液，沉淀保存?zhèn)溆?，上清液繼續(xù)加入中性鹽至 飽和度60%，中性鹽完全溶解后放置一段時間，低溫離心后，分別收集沉淀和上清液，沉淀保存?zhèn)溆?，上清液繼續(xù)加入中性鹽至飽和度80%，中性鹽完全溶解后放置一段時間，低溫離心后，分別收集沉淀和上清液，沉淀保存?zhèn)溆?，上清液繼續(xù)加入中性鹽至飽和度100%，中性鹽完全溶解后放置一段時間，低溫離心后，分別收集沉淀保存?zhèn)溆茫? 離子交換層析方法的步驟如下: 將昆蟲血淋巴收集液,按從昆蟲血淋巴收集液分離純化酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組分技術的特征要求，用酸性溶液或堿性溶液調PH至要求條件范圍內并置于特征要求的溫度，優(yōu)選0°C -1O0C ;將樣品溶液上樣于預先用緩沖液平衡好的離子交換層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白，洗脫方式，采用鹽濃度階段方式，分別用0.1mol/L、0.2mol/L、，0.5mol/L、lmol/L、2mol/L、3mol/L鹽溶液進行階段洗脫；也可以采用鹽濃度梯度方式，梯度從0.00mOl/L-3mOl/L;離子交換層析分離純化中:(1)層析介質選擇陽離子交換層析添料，選自CM-離子交換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH2-pH7 ； (2)層析介質選擇陰離子交換層析添料,選自Q-離子交換層析添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12 ； (3)洗脫的鹽溶液可以選擇規(guī)定濃度的緩沖液或在緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；⑷中性鹽選擇(NH4)2SO4Na2SO4或NaCl或KCl，優(yōu)選NaCl ； 疏水層析方法的步驟如下: 將昆蟲血淋巴收集液,按從昆蟲血淋巴收集液分離純化酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組分技術的特征要求，用酸性溶液或堿性溶液調pH至要求條件范圍內并置于特征要求的溫度，優(yōu)選0°C -1O0C ;樣品溶液中加入中性鹽至3mol/L濃度，上樣于預先用緩沖液平衡好的疏水層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白，洗脫方式，采用鹽濃度階段方式，分別米用 2.5mol/L、2.0mol/L、l.5mol/L、l.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.lmol/L、0.0moI/L中性鹽溶液進行階段洗脫；也可以采用鹽濃度梯度方式，梯度從3mol/L-0.0mol/L ;疏水層析分離純化中:(1)疏水層析介質選擇苯基-疏水層析添料、正辛烷-疏水層析添料、己烷-疏水層析添料、丁烷-疏水層析添料；(2)中性鹽選擇(NH4)#04或Na2SO4或NaCl，優(yōu)選(NH4)2SO4 ; (3)洗脫的鹽溶液可以選擇規(guī)定濃度的緩沖液或在緩沖液中加中性鹽到需要的濃度； 凝膠過濾層析方法的步驟如下: 將昆蟲血淋巴收集液,按從昆蟲血淋巴收集液分離純化酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性組分技術的特征要求，用酸性溶液或堿性溶液調PH至要求條件范圍內并置于特征要求的溫度，優(yōu)選0°C -1O0C ;樣品液上樣于預先用緩沖液平衡好的凝膠過濾層析柱并進行分離純化洗脫，；洗脫方式，采用與上樣緩沖溶液相同的溶液進行洗脫；凝膠層析分離純化中:(I)層析介質可以選擇 Sephacryl S-1OO HR>Sephacryl S-200 HR>Sephadex G~50>Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150 或 Superose 12 prep grade、Superose 6 prep grade、Superdex 30 prep grade、Superdex 75 prep grade、Superose 12 HR、Superose 6 HR、Superdex Peptide、 或 Superdex 75 HR、Superdex Peptide PE 等凝膠層析添料；(2)洗脫液的離子濃度為0-1.5M，優(yōu)選0.15M-0.8M。
8.根據權利要求1或2或3或4或5或6所述的應用，其特征在于，所述的昆蟲血淋巴通過收集和儲存過程獲得，所述的收集過程使用的器械、溶液、容器均處無菌狀態(tài)，且不含有微生物相關分子模式；收集后的血淋巴放置于中性鹽溶液、含有酚氧化酶原激活系統(tǒng)抑制劑的溶液、含抗凝劑的溶液、或直接收集至液氮或干冰中，或上述條件的任何組合。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的昆蟲為鱗翅目(Lepidoptera)、天(大)蠶蛾科(Satumiidae)昆蟲,選自昨蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度昨蠶、琥拍蠶、美國昨蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶，所述的昆蟲為任何地域的天然或人工放養(yǎng)或人工飼養(yǎng)的昆蟲。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述中性鹽選自硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉，飽和度為10% -90% ;所述的溶液選自蒸餾水、無離子水、生理鹽水、昆蟲生理鹽水、緩沖液；所述的抗凝劑至少包含下列抗凝成分中的一種或其組合:1)肝素，濃度為0.01mg/ml-10mg/ml,優(yōu)選0.05mg/ml-lmg/ml ；2)水溶性檸檬酸鹽，檸檬酸根濃度為0.0Olmol/L-0.5mol/L,優(yōu)選 0.01mol/L-0.5mol/L ；3)水溶性草酸鹽，草酸根濃度為 0.01mg/ml-10mg/ml,優(yōu)選0.05mg/ml-lmg/ml ;所述的抑制劑優(yōu)選苯甲脒、苯甲基磺酸氟化物,鹿糖,二異丙基氟磷酸或苯甲脒、苯甲基磺酸氟化物、二異丙基氟磷酸、蔗糖的任何組合，抑制劑濃度優(yōu)選lmmol/L-30mmol/L ;收集用溶液酸堿度在pH2_pH13,優(yōu)選pH4_pH9。
11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于，所述的緩沖液為緩沖離子對所組成的緩沖液，緩沖離子對選自檸檬酸根緩沖離子對、HCl-Tris緩沖離子對、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對、磷酸根緩沖離子對、醋酸根緩沖離子對、硼酸根緩沖離子對、硼酸-Tris緩沖離子對以及上述各緩沖離子的組合；所述緩沖液的離子強度在0.0Olmol/L-lmol/L，優(yōu)選.0.01mol/L-0.5mol/L。
12.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，在收集用溶液中加入二價金屬離子螯合劑，優(yōu)選EDTA或TDTA，二價金屬離子螯合劑的優(yōu)選濃度在0.0ImmoI/L-1OOmmoI/L0
【文檔編號】C12Q1/26GK103789254SQ201210436927
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月26日 優(yōu)先權日:2012年10月26日
【發(fā)明者】張嶸, 趙明沂, 張景海, 吳春福 申請人:沈陽藥科大學