專利名稱：生物除磷微生物檢測用培養(yǎng)基及檢測生物除磷微生物除磷能力的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種除磷微生物檢測用培養(yǎng)基及檢測生物除磷微生物除磷能力的方法。
背景技術：
目前檢測生物除磷微生物純菌株除磷能力的方法是將從生物除磷系統(tǒng)中篩選出來的純菌株置于含有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，再分析培養(yǎng)后的菌液中的磷酸鹽含量，從而得到純菌株的除磷能力，但該方法還存在以下問題1、該法針對性差，它只是純菌株的富集與繁殖過程，在這種有氧條件下，不管何種微生物都可以吸收底物中的碳源和 磷酸鹽進行菌株繁殖，所以測得的最終結果并不真實；2、該法所采用的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分不合理，使得培養(yǎng)之后的生物除磷微生物失去了在反應器運行條件下的除磷能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的檢測生物除磷微生物除磷能力的方法針對性差，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不合理的問題。而提供了一種生物除磷微生物檢測用培養(yǎng)基及檢測生物除磷微生物除磷能力的方法。本發(fā)明生物除磷微生物檢測用培養(yǎng)基為生物除磷微生物所依次進行檢測用的兩種培養(yǎng)基，按照用于檢測的順序兩種培養(yǎng)基分別為厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基；其中每升厭氧檢測培養(yǎng)基是由O. 3 O. 5g的NaAc、27(T290mg的(NH4) 2S04、27 29mg的CaCl2 *2H20,350"370mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 O. 7mL 的微量元素液、I. 8 2. 4mL 的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧檢測培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4 ;每升好氧檢測培養(yǎng)基是由7(T80mg的 KH2P04、125 135mg 的 K2HPO4、260 300mg 的(NH4) 2S04、26 30mg 的 CaCl2 · 2H20、340 380mg的MgSO4 · 7H20、0. 5^1. 2mL的微量元素液、I. 5^3mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧檢測培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4。其中，厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基中的微量元素液中的組分及濃度如下FeCl3 · 6H20 的濃度為 2. 5^3. 5g/L、H3BO3 的濃度為 O. 25、· 35g/L，CuSO4 · 5H20 的濃度為
O.05 O. 07g/L、KI 的濃度為 O. 32 O. 4g/L、MnCl2 ·4Η20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L、Na2MO4 · 2H20的濃度為 O. Γ0. 14g/L、ZnSO4 · 7H20 的濃度為 O. 2^0. 28g/L 和 CoCl2 · 6H20 的濃度為
O.28 O. 32g/L。維生素液中的組分及濃度如下維生素B1的濃度為8(Tl20mg/L、維生素B2濃度為8(Tl20mg/L、維生素B6的濃度為18(T220mg/L、維生素B12的濃度為I. 8 2. 2g/L、葉酸的濃度為36 44mg/L、煙酸的濃度為8(Tl20mg/L,泛酸I丐的濃度為8(Tl20mg/L、對氨基苯甲酸的濃度為8(Tl20mg/L和生物素的濃度為36 44mg/L。本發(fā)明檢測生物除磷微生物除磷能力的方法按照以下步驟進行一、配制上面所述的厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基；二、取ImL分離得到的純菌株的菌液置于50mL步驟一配制的好氧檢測培養(yǎng)基中，在16 20°C搖床中培養(yǎng)f I. 5天，再將培養(yǎng)得到的菌液倒入50mL的離心管中，在500(Γ6000轉/分的條件下離心1(Γ 5分鐘，棄上清留沉淀；三、再向50mL離心管中加入30ml步驟一配制的厭氧檢測培養(yǎng)基混勻，向50mL離心管中充入氮氣10分鐘，密封置于17 21 °C的搖床中培養(yǎng)I. 5 2. 5小時；四、將離心管置于500(Γ6000轉/分的條件下離心1(Γ15分鐘，棄上清留沉淀；五、再向步驟四50mL的離心管中加入30ml步驟一配制的好氧檢測培養(yǎng)基混勻，在室溫條件下曝氣I. 5^2. 5小時；六、將離心管置于5000^6000轉/分的條件下離心1(Γ15分鐘，棄上清留沉淀；七、循環(huán)操作步驟三至六1(Γ 5次進行純菌株的馴化；八、向含有馴化后菌株的50mL離心管內(nèi)加入步驟一配制的厭氧檢測培養(yǎng)基30ml混合均勻，向50mL的離心管中充入氮氣10分鐘，密封置于17 21 °C的搖床中培養(yǎng)I. 5 2. 5小時；九、將離心管置于5000 6000轉/分的條件下離心1(Γ 5分鐘，棄上清留沉淀；十、向步驟八50mL的離心管中加入好氧檢測培養(yǎng)基，培養(yǎng)I. 5^2. 5小時，用鑰酸銨分光光度法測定培養(yǎng)得到的菌液中的磷濃度為b、好氧檢測培養(yǎng)基中的磷濃度為a，純菌株的除磷率為(1-b/a) X100%，即確定了生物除磷微生物的除磷性能；其中好氧檢測培養(yǎng)基與離心管的體積比為0.5 :1。十一、對步驟九得到的純菌株進行鏡檢，確定檢測得到的純菌株為生物除磷微生物。在厭氧培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程中，生物除磷微生物分解體內(nèi)的聚磷顆?；蛱窃尫拍芰课誑aAc形成聚-beta-羥基-鏈烷酸酯(PHAs);在好氧培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，生物除磷微生物分解在體內(nèi)的的PHAs作為能量來源吸收磷酸鹽或合成糖原；本發(fā)明的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分合理，與現(xiàn)有的檢測用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基相比，本發(fā)明方法充分考慮到生物除磷微生物在反應器中的生長環(huán)境，馴化生物除磷微生物出現(xiàn)除磷能力，及所用的檢測培養(yǎng)基適合生物除磷微生物的生長及馴化。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一純菌株的性能檢測方法按照以下步驟進行一、配制如權利要求I所述的厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基；二、取ImL分離得到的純菌株的菌液置于50mL步驟一配制的好氧檢測培養(yǎng)基中，在16 20°C搖床中培養(yǎng)f I. 5天，再將培養(yǎng)得到的菌液倒入50mL的離心管中，在500(Γ6000轉/分的條件下離心1(Γ 5分鐘，棄上清留沉淀；三、再向50mL離心管中加入30ml步驟一配制的厭氧檢測培養(yǎng)基混勻，向50mL離心管中充入氮氣10分鐘，密封置于17 21 °C的搖床中培養(yǎng)I. 5 2. 5小時；四、將離心管置于500(Γ6000轉/分的條件下離心1(Γ15分鐘，棄上清留沉淀；五、再向步驟四50mL的離心管中加入30ml步驟一配制的好氧檢測培養(yǎng)基混勻，在室溫條件下曝氣I. 5^2. 5小時；六、將離心管置于5000^6000轉/分的條件下離心1(Γ15分鐘，棄上清留沉淀；七、循環(huán)操作步驟三至六1(Γ 5次進行純菌株的馴化；八、向含有馴化后菌株的50mL離心管內(nèi)加入步驟一配制的厭氧檢測培養(yǎng)基30ml混合均勻，向50mL的離心管中充入氮氣10分鐘，密封置于17 21°C的搖床中培養(yǎng)I. 5 2. 5小時；九、將離心管置于5000 6000轉/分的條件下離心1(Γ 5分鐘，棄上清留·沉淀；十、向步驟八50mL的離心管中加入好氧檢測培養(yǎng)基，培養(yǎng)I. 5^2. 5小時，用鑰酸銨分光光度法測定培養(yǎng)得到的菌液中的磷濃度為b、好氧檢測培養(yǎng)基中的磷濃度為a，純菌株的除磷率為(1-b/a) X 100%，即確定了生物除磷微生物的除磷性能；其中好氧檢測培養(yǎng)基與離心管的體積比為O. 5 1 ;十一、對步驟九得到的純菌株進行鏡檢，確定檢測得到的純菌株為生物除磷微生物。
本實施方式步驟一中每升厭氧檢測培養(yǎng)基是由O. 3^0. 5g的NaAc、27(T290mg的(NH4)2S04、27 29mg 的 CaCl2 · 2H20、350 370mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 O. 7mL 的微量元素液、
1.8^2. 4mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧檢測培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ;每升好氧檢測培養(yǎng)基是由 70 80mg 的 KH2P04、125 135mg 的 K2HPO4、260 300mg 的(NH4) 2S04、26 30mg的 CaCl2 · 2H20、34(T380mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 I. 2mL 的微量元素液、I. 5 3mL 的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧檢測培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4。其中厭氧檢測培養(yǎng)基和好氧檢測培養(yǎng)基中的微量元素液中FeCl3 · 6H20的濃度為
2.5 3. 5g/L,H3BO3 的濃度為 O. 25 O. 35g/L, CuSO4 ·5Η20 的濃度為 O. 05 O. 07g/L、KI 的濃度為 O. 32 O. 4g/L、MnCl2 · 4H20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L、Na2MO4 · 2H20 的濃度為 O. I O. 14g/L、ZnSO4 ·7Η20的濃度為O. 2^0. 28g/L和CoCl2 ·6Η20的濃度為O. 28、· 32g/L。厭氧檢測培養(yǎng)基和好氧檢測培養(yǎng)基中的維生素液由濃度為8(Tl20mg/L的維生素B1、濃度為8(Tl20mg/L的維生素B2、濃度為18(T220mg/L維生素B6、濃度為I. 8 2. 2g/L的維生素B12、濃度為36 44mg/L的葉酸、濃度為8(Tl20mg/L的煙酸，濃度為8(Tl20mg/L的泛酸鈣、濃度為8(Tl20mg/L的對氨基苯甲酸和濃度為36 44mg/L的生物素組成。本實施方式步驟七中向50mL離心管中加入30ml好氧檢測培養(yǎng)基，在室溫條件下曝氣I. 5 2小時，分別在培養(yǎng)到20分鐘、40分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘時取樣O. 6ml,置于I. 5ml離心管中，500(Γ6000轉/分離心10分鐘之后，分別取O. 5ml上清液于另一個I. 5ml離心管中，用鑰酸銨分光光度法測定菌液中的磷濃度，記錄檢測得到的最高磷濃度為b0具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟i^一中對純菌株進行鏡檢，通過鏡檢觀察確定具體實施方式
四分離得到純菌株的形態(tài)是四聚體形態(tài)，即確定出純菌株為生物除磷微生物中的聚糖菌。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。本實施方式的檢測過程均在超凈工作臺中進行，并觀察步驟三中的厭氧檢測培養(yǎng)基中乙酸的變化，步驟四中的好氧檢測培養(yǎng)基中磷酸鹽的變化；其中在厭氧培養(yǎng)階段乙酸吸收量保持在30mg左右，在好氧培養(yǎng)階段磷酸鹽吸收量都保持在3. 8mg左右，本實施方式步驟三、四的培養(yǎng)過程中生物除磷微生物得到馴化，使其能夠在厭氧培養(yǎng)階段釋放磷酸鹽，而在好氧培養(yǎng)階段吸收磷酸鹽；本實施方式的針對性強，本實施方式所用的培養(yǎng)基適合生物除磷微生物的馴化和除磷能力的檢測。本實施方式對32株生物除磷微生物進行性能檢測和鏡檢，檢測結果如表I所示，其中除磷率低于20%的為非除磷微生物。表I
種屬I菌株I除磷率(％)
Acinetobacters^.P38 8. 9
Acinetobacters^.P19 23
Acinetobacters^.P4 100
Acinetobacters^.PlO 90. 2
Acinetobacters^.P43 28. 5
Acinetobacters^.P48 33. 權利要求
1.生物除磷微生物檢測用培養(yǎng)基，其特征在于所述的檢測用培養(yǎng)基為生物除磷微生物純菌株所依次進行檢測用的兩種培養(yǎng)基，按照用于檢測的順序兩種培養(yǎng)基分別為厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基；其中每升厭氧檢測培養(yǎng)基是由O. 3^0. 5g的NaAc、27(T290mg的(NH4)2SO4'27 29mg 的 CaCl2 · 2H20、350 370mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 O. 7mL 的微量元素液、I.8^2. 4mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧檢測培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ;每升好氧檢測培養(yǎng)基是由 70 80mg 的 KH2P04、125 135mg 的 K2HPO4、260 300mg 的(NH4) 2S04、26 30mg的 CaCl2 · 2H20、34(T380mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 I. 2mL 的微量元素液、I. 5 3mL 的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧檢測培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4。
2.根據(jù)權利要求I所述的生物除磷微生物檢測用培養(yǎng)基，其特征在于厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基中的微量元素液中的組分及濃度如下=FeCl3 ·6Η20的濃度為2. 5^3. 5g/L、H3BO3 的濃度為 O. 25 O. 35g/L，CuSO4 · 5H20 的濃度為 O. 05 O. 07g/L、KI 的濃度為O.32 O. 4g/L、MnCl2 · 4H20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L、Na2MO4 · 2H20 的濃度為 O. I O. 14g/L、ZnSO4 · 7H20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L 和 CoCl2 · 6H20 的濃度為 O. 28 O. 32g/L。
3.根據(jù)權利要求I所述的生物除磷微生物檢測用培養(yǎng)基，其特征在于厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基中的維生素液中的組分及濃度如下維生素B1的濃度為8(Tl20mg/L、維生素B2濃度為8(Tl20mg/L、維生素B6的濃度為18(T220mg/L、維生素B12的濃度為I. 8 2. 2g/L、葉酸的濃度為36 44mg/L、煙酸的濃度為8(Tl20mg/L，泛酸鈣的濃度為80 120mg/L、對氨基苯甲酸的濃度為80 120mg/L和生物素的濃度為36 44mg/L。
4.檢測生物除磷微生物除磷能力的方法，其特征在于檢測生物除磷微生物除磷能力的方法按照以下步驟進行 (O配制如權利要求I所述的厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基； (2)取分離得到的純菌株的菌液置于步驟一配制的好氧檢測培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，再將培養(yǎng)得到的菌液倒入離心管中，離心，棄上清留沉淀； (3)再向離心管中加入步驟一配制的厭氧檢測培養(yǎng)基混勻，向離心管中充入氮氣，密封置于搖床中培養(yǎng)； (4)將離心管離心1(Γ15分鐘，棄上清留沉淀； (5)再向步驟(4)的離心管中加入步驟一配制的好氧檢測培養(yǎng)基混勻，在室溫條件下曝氣; (6)將離心管離心1(Γ15分鐘，棄上清留沉淀； (7)循環(huán)操作步驟(3)- (6) 10 15次進行純菌株的馴化； (8)向含有馴化后菌株的離心管內(nèi)加入步驟一配制的厭氧檢測培養(yǎng)基混合均勻，向離心管中充入氮氣，密封置于搖床中培養(yǎng)； (9)將離心管離心1(Γ15分鐘，棄上清留沉淀； (10)向步驟(8)的離心管中加入好氧檢測培養(yǎng)基，培養(yǎng)，用鑰酸銨分光光度法測定培養(yǎng)得到的菌液中的磷濃度為b、好氧檢測培養(yǎng)基中的磷濃度為a，純菌株的除磷率為(1-b/a) X 100%，即確定了生物除磷微生物的除磷性能；其中好氧檢測培養(yǎng)基與離心管的體積比為 O. 5 :1 ; (11)對步驟(9)得到的純菌株進行鏡檢，確定檢測得到的純菌株為生物除磷微生物。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中取ImL分離得到的純菌株的菌液置于50mL步驟(I)配制的好氧檢測培養(yǎng)基中，在16 20°C搖床中培養(yǎng)f I. 5天，再將培養(yǎng)得到的菌液倒入50mL的離心管中，在5000 6000轉/分的條件下離心1(Γ 5分鐘，棄上清留沉淀。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(3)中向50mL離心管中加入30ml步驟(I)配制的厭氧檢測培養(yǎng)基混勻，向50mL離心管中充入氮氣10分鐘，密封置于17 21°C的搖床中培養(yǎng)I. 5 2. 5小時。
7.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)、(6)、(9)中將離心管置于5000^6000轉/分的條件下離心1(Γ15分鐘，棄上清留沉淀。
8.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于同，步驟(5)中，向步驟(4)50mL的離心管中加入30ml步驟(I)配制的好氧檢測培養(yǎng)基混勻，在室溫條件下曝氣I. 5^2. 5小時。
9.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(8)中向含有馴化后菌株的50mL離心管內(nèi)加入步驟一配制的厭氧檢測培養(yǎng)基30ml混合均勻，向50mL的離心管中充入氮氣10分鐘，密封置于17 21°C的搖床中培養(yǎng)I. 5^2. 5小時。
10.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于對步驟(11)中的純菌株進行鏡檢，通過鏡檢觀察確定分離得到純菌株的形態(tài)為四聚體形態(tài)，即確定純菌株為生物除磷微生物中的聚糖菌。
全文摘要
生物除磷微生物檢測用培養(yǎng)基及檢測生物除磷微生物除磷能力的方法，它涉及一種除磷微生物檢測用培養(yǎng)基及檢測除磷微生物除磷能力的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的檢測用培養(yǎng)基針對性差，所用的培養(yǎng)基不適合生物除磷微生物除磷能力檢測，及除磷微生物除磷方法不當?shù)膯栴}。檢測用培養(yǎng)基為厭氧檢測培養(yǎng)基、好氧檢測培養(yǎng)基；方法一、配制培養(yǎng)基；二、取除磷微生物純菌液；三、厭氧檢測培養(yǎng)基；四、好氧檢測培養(yǎng)基；六、厭氧檢測培養(yǎng)基；七、循環(huán)操作四至六2~4次、八、除磷能力檢測；九、對純菌株進行鏡檢。本發(fā)明方法針對性強，培養(yǎng)基適合除磷微生物的生長及除磷能力檢測。
文檔編號C12Q1/04GK102911997SQ20121043787
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權日2012年11月6日
發(fā)明者亢涵 申請人:沈陽建筑大學