專利名稱：一種微流體細(xì)胞捕獲芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞捕獲工具及其制備方法，尤其涉及一種分離、富集和識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體細(xì)胞捕獲芯片及其制備方法，該微流體細(xì)胞捕獲芯片可用作為腫瘤診斷、輔助治療、及生化分析研究的有利工具。
背景技術(shù)：
目前，腫瘤診斷通常根據(jù)大量病理狀況進(jìn)行診斷。這類方法，例如活檢或直腸癌指檢通常采取侵入性分析，具有一定程度的創(chuàng)傷性，不利于病患。
另外也有采用外周血中生物分子標(biāo)志物進(jìn)行檢查，例如血清學(xué)參數(shù)(PSA劑量)檢測(cè)，由于其敏感性和特異性都不是很理想，使得癌癥診斷和治療較難取得良好效果。
對(duì)許多癌癥患者而言，其死亡主要是由于轉(zhuǎn)移瘤引起的。當(dāng)病人手術(shù)切除主要腫瘤后，目前檢測(cè)手段很難及時(shí)反應(yīng)治療情況，鑒定轉(zhuǎn)移瘤，指導(dǎo)后續(xù)的放化療過(guò)程，從而導(dǎo)致病人錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)和無(wú)法及時(shí)有效調(diào)整無(wú)效治療和用藥方案。因此不能夠成功治療所有的轉(zhuǎn)移瘤，導(dǎo)致病人最終死亡。從臨床角度看來(lái)，轉(zhuǎn)移瘤可以看作是癌癥自然發(fā)展過(guò)程中的結(jié)論性事件。
人們急待開(kāi)發(fā)非創(chuàng)傷性過(guò)程從患者提取腫瘤細(xì)胞樣品的工具。
循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指在血液中以極低水平存在的活實(shí)體瘤細(xì)胞。隨著對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究的不斷深入，富集和鑒定這些細(xì)胞已經(jīng)成為輔助癌癥診斷的一種方法。監(jiān)管機(jī)構(gòu)(例如FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)一些基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲、鑒定系統(tǒng)的臨床應(yīng)用。
為了分離和富集體液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞和擴(kuò)散腫瘤細(xì)胞，人們利用這類細(xì)胞尺寸、 表面分子表達(dá)等特點(diǎn)開(kāi)發(fā)出一些相應(yīng)的捕獲、富集方法(例如，多孔濾膜法、免疫磁珠富集法)。
傳統(tǒng)的多孔濾膜法存在缺點(diǎn)有(I)孔徑單一與實(shí)際臨床病人細(xì)胞尺寸多樣性不符，存在遺漏現(xiàn)象；(2)試劑消耗量大，難以進(jìn)行后期鑒定工作；(3)容易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(4)專用濾膜制備工藝復(fù)雜，成本較高。
免疫識(shí)別富集法，主要有磁珠富集和芯片富集兩種。由于生物的復(fù)雜性與多樣性， 體液中腫瘤細(xì)胞可能存在細(xì)胞特征識(shí)別基團(tuán)退化，從而導(dǎo)致免疫識(shí)別效率下降，導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性出現(xiàn)。無(wú)論磁珠富集和芯片富集，都存在細(xì)胞與免疫識(shí)別基團(tuán)接觸幾率不高、結(jié)合不牢，影響最后檢測(cè)和診斷情況。同時(shí)此類芯片成本較高，不易于加工。為此要對(duì)現(xiàn)有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離、富集方法進(jìn)行改進(jìn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提出一種能夠通過(guò)從人體液體樣本中分離、富集罕見(jiàn)細(xì)胞的微流體細(xì)胞捕獲芯片，以解決現(xiàn)有技術(shù)中侵入采樣等問(wèn)題。
解決本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是提供一種微流體細(xì)胞捕獲芯片，其包括上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料,所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料之間形成有一條溝道，所述溝道具有入口和出口，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料至少一個(gè)是透明的材料， 所述溝道從入口到出口的高度由高向低逐漸過(guò)渡且呈楔形或者溝道部分區(qū)域呈楔形，所述溝道最低處接近或小于至少一種目標(biāo)細(xì)胞尺寸。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述溝道的寬度為O. 05 200毫米，長(zhǎng)度為I 500毫米。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述溝道的上下底面沉積一層納米顆粒層或納米纖維層或用于增加細(xì)胞與接觸面間摩擦阻力的微納結(jié)構(gòu)。其中，所述納米顆粒層或納米纖維層為納米Ti02、SiO2或者Fe2O3O
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)所述上部硬質(zhì)材料或者下部硬質(zhì)材料的至少一個(gè)表面進(jìn)行免疫修飾，能夠至少對(duì)一種目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分子特異性識(shí)別。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述溝道的入口處，在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料之間塞有厚度為5(Γ200微米厚的鋼片，在所述溝道的出口處，在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料之間塞有厚度為廣50微米厚的鋼片，所述溝道在所述兩塊鋼片之間形成。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料均為玻璃或者亞克力材料。
解決本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題所采用的另一技術(shù)方案是提供一種微流體細(xì)胞捕獲芯片的制作方法，其包括如下步驟
步驟一、將上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料重疊在一起；
步驟二、在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料重疊的一端塞入厚鋼片并用夾具壓緊，在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料重疊的另一端塞入薄鋼片并用夾具壓緊，從而在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料中間形成楔形溝道；
步驟三、在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料的側(cè)邊用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，使人體液體樣本不能從所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料的側(cè)邊流出；
步驟四、所述楔形溝道的兩端也用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，在厚鋼片處設(shè)置通孔以形成所述楔形溝道的入口，在薄鋼片處設(shè)置通孔以形成所述楔形溝道的出口，人體液體樣本能從所述楔形溝道的入口流入，并從所述楔形溝道的出口流出。
作為本發(fā)明的制作方法的進(jìn)一步改進(jìn)，進(jìn)一步包括步驟五、在所述楔形結(jié)構(gòu)的入口和出口分別插上能使人體液體樣本通過(guò)的孔針。
作為本發(fā)明的制作方法的進(jìn)一步改進(jìn)，厚鋼片的厚度為5(Γ200微米，薄鋼片的厚度為f 50微米。
作為本發(fā)明的制作方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述溝道的寬度為O. 05 200毫米，長(zhǎng)度為I 500毫米。
作為本發(fā)明的制作方法的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟一中，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料的表面沉積一層納米顆粒層或納米纖維層或有利于增加細(xì)胞與接觸面摩擦力的微納結(jié)構(gòu)。其中，所述納米顆粒層或納米纖維層為納米Ti02、SiO2或者Fe203。
作為本發(fā)明的制作方法的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)所述上部硬質(zhì)材料或者下部硬質(zhì)材料的至少一個(gè)表面進(jìn)行免疫修飾，能夠至少對(duì)一種目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分子特異性識(shí)別。
作為本發(fā)明的制作方法的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)所述至少一個(gè)表面進(jìn)行修飾步驟為步驟一、用無(wú)水乙醇配制4%的3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液，將其注滿芯片溝道，在常溫下反應(yīng)I小時(shí)后用無(wú)水乙醇沖洗5分鐘；步驟二、用二甲亞砜將蛋白質(zhì)交聯(lián)劑4-馬來(lái)酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯配制成I μ mol/mL的溶液，再將其注入芯片溝道，在常溫下反應(yīng) 45min后用無(wú)水乙醇沖洗5分鐘；步驟三、用磷酸鹽緩沖液配制50 μ g/mL的鏈霉親和素溶液，再將其注入芯片溝道，然后置入4°C冰箱中過(guò)夜反應(yīng)后用pH=7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗5分鐘；步驟四、將上皮細(xì)胞黏附因子抗體溶液注入芯片溝道，并在常溫下靜置反應(yīng) 1-2小時(shí)后用PBS將溝道沖洗5分鐘。
作為本發(fā)明的制作方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料均為玻璃或者亞克力材料。
本發(fā)明采用非侵入式方式從患者提取人體液體樣本，將人體液體樣本從微溝道芯片的入口注入，由于微溝道的高度呈楔形分布，目標(biāo)細(xì)胞在溝道中通過(guò)時(shí)將實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分離和富集。本發(fā)明的微流體細(xì)胞捕獲芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于制作、成本低廉，能夠?qū)Σ煌叽绾途哂刑禺愋苑肿颖磉_(dá)的細(xì)胞進(jìn)行快速高效分離、富集。


下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中
圖I為以本發(fā)明微流體細(xì)胞捕獲芯片的實(shí)施例的結(jié)構(gòu)不意圖2為本發(fā)明微流體細(xì)胞捕獲芯片的縱截面放大示意圖3為本發(fā)明微流體細(xì)胞捕獲芯片的細(xì)胞分離的示意圖。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
如圖I至圖3所示，本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種微流體細(xì)胞捕獲芯片100，用于捕獲微流體細(xì)胞200。該微流體細(xì)胞捕獲芯片100包括上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20，該上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之間形成有一條溝道30，該溝道具有入口 32和出口 34，該溝道30從入口 32到出口 34的高度由高向低逐漸過(guò)渡且呈楔形或者溝道部分區(qū)域呈楔形，該溝道最低處接近或小于至少一種目標(biāo)細(xì)胞尺寸。在本實(shí)施例中，微流體細(xì)胞200為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在本實(shí)施例中，不限于本發(fā)明的這些透明玻璃片，這些透明玻璃片可以用透明的硬質(zhì)材料替代，，例如亞克力材料，并且，上部透明玻璃片和下部透明玻璃片也可以用一個(gè)透明的硬質(zhì)材料和一個(gè)不透明的硬質(zhì)材料替代，也就是說(shuō)，兩者之中只要其中一個(gè)是透明的硬質(zhì)材料即可。
該溝道30的寬度為O. 05 200毫米，長(zhǎng)度為I 500毫米。該上部透明玻璃片 10或者下部透明玻璃片20的至少一個(gè)表面可進(jìn)行表面修飾。對(duì)該至少一個(gè)表面進(jìn)行表面修飾步驟為步驟一、用無(wú)水乙醇配制4%的3-巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)溶液，將其注滿芯片溝道，在常溫下反應(yīng)I小時(shí)后用無(wú)水乙醇沖洗5分鐘；步驟二、用二甲亞砜(DMSO)將蛋白質(zhì)交聯(lián)劑4-馬來(lái)酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯(GMBS)配制成I μ mol/mL的溶液，再將其注入芯片溝道，在常溫下反應(yīng)45min后用無(wú)水乙醇沖洗5分鐘；步驟三、用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制50μ g/mL的鏈霉親和素(SA)溶液，再將其注入芯片溝道，然后置入4°C冰箱6中過(guò)夜反應(yīng)后用PBS (磷酸鹽緩沖液，pH=7. 2-7. 4)溶液清洗5分鐘；步驟四、將上皮細(xì)胞黏附因子抗體(Anti-EpCAM)溶液注入芯片溝道，并在常溫下靜置反應(yīng)1_2小時(shí)后用PBS將溝道沖洗5分鐘。在經(jīng)過(guò)表面修飾以后可對(duì)至少一種目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分子識(shí)別的特異性抗體。 在該溝道30的入口 32處，在該上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之間塞有厚度為 50 200微米厚的鋼片40，在該溝道30的出口 34處，在該上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之間塞有厚度為f 50微米厚的鋼片40，該溝道在該兩塊鋼片40之間形成。
本發(fā)明實(shí)施例提供的一種能夠通過(guò)從人體有機(jī)液體樣本中分離、富集細(xì)胞的微流體細(xì)胞捕獲芯片，該微流體細(xì)胞捕獲芯片100內(nèi)的溝道30高度按一定規(guī)律變化，且溝道30 上下底面通過(guò)特殊處理(即在該溝道上下底面的玻璃表面沉積一層Ti02、Si02或者Fe2O3等納米薄膜或者納米纖維或有利于增加細(xì)胞與接觸面摩擦力的微納結(jié)構(gòu)，其厚度為5 200納米)提高目標(biāo)細(xì)胞捕獲效率。本發(fā)明的微流體細(xì)胞捕獲芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于制作、成本低廉， 能夠?qū)Σ煌叽绾途哂刑禺愋苑肿颖磉_(dá)的細(xì)胞進(jìn)行快速高效分離、富集。
本發(fā)明的微流體細(xì)胞捕獲芯片100以非手動(dòng)方式分離、富集該細(xì)胞。該細(xì)胞是基于液體流動(dòng)在微流體細(xì)胞捕獲芯片里自動(dòng)分離和富集。本發(fā)明的微流體細(xì)胞捕獲芯片，該細(xì)胞至少用一種類型的示蹤物標(biāo)記識(shí)別。本發(fā)明采用非侵入式方式從患者提取人體液體樣本，將人體液體樣本從微流體細(xì)胞捕獲芯片100的入口 32注入，由于溝道30的高度呈楔形分布，目標(biāo)細(xì)胞在溝道30中通過(guò)時(shí)將實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分離和富集。
本發(fā)明還提供了一種微流體細(xì)胞捕獲芯片的制作方法，其包括如下步驟
步驟一、將上下兩片透明玻璃片10、20重疊在一起；
步驟二、在兩玻璃片重疊的一端塞入厚度為5(Γ200微米厚的精密鋼片40并用夾具壓緊，在兩玻璃片重疊的另一端塞入厚度為f 50微米厚的精密鋼片并用夾具壓緊，從而在兩玻璃片中間形成楔形溝道30 ；
步驟三、兩玻璃片的側(cè)邊用聚二甲基硅氧烷(PDMS)封涂，然后在加熱臺(tái)上烘干，使人體液體樣本不能從玻璃片的側(cè)邊流出；
步驟四、該楔形溝道的兩端也用聚二甲基硅氧烷封涂烘干，并在兩端打孔，使人體液體樣本能從圖I所示的楔形溝道30的入口 32流入，并從出口 34流出；
步驟五、在圖I所示的楔形溝道30的入口 32和出口 34分別插上能使人體液體樣本通過(guò)的孔針，這樣，該微流體細(xì)胞捕獲芯片就制作完成了。
實(shí)驗(yàn)原理
(I)如圖I所示，本發(fā)明采用楔形溝道結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，在兩玻璃片中間形成的溝道的寬度為O. 05 200毫米，溝道長(zhǎng)度為10 500毫米的楔形溝道；
(2)本發(fā)明的楔形溝道的入口高度為5(Γ200微米，出口高度為f 50微米，當(dāng)人體液體樣本通過(guò)入口流入楔形溝道時(shí)，由于流體空間的限制，隨人體液體樣本流入的目標(biāo)捕獲細(xì)胞將在特定的位置卡??；
(3)此實(shí)驗(yàn)的基本思路是將待檢測(cè)的患者的人體液體樣本通過(guò)本發(fā)明的楔形微流體細(xì)胞捕獲芯片，最終使不同尺寸的目標(biāo)細(xì)胞在溝道中通過(guò)時(shí)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分離和富集。
實(shí)驗(yàn)步驟
(I)依據(jù)發(fā)明的制作方法，制作出帶有圖I所示的微流楔形循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲芯片；
(2)將待檢測(cè)人體液體樣本從上述芯片的入口注入，并在芯片的出口處收集目標(biāo)細(xì)胞分離后的人體液體樣本；
(3)繼續(xù)通過(guò)入口加入磷酸鹽緩沖溶液(即PBS溶液，pH=7. 2-7. 4，NaC1137mmol/ L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 I. 4mmol/L)進(jìn)行清洗；
(4)繼續(xù)通過(guò)入口選擇加入示蹤物質(zhì)(如染細(xì)胞核的突光染料如DAPI或者 Hoechst染料)或加入免疫試劑，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別；
(5)再次通過(guò)入口加入PBS進(jìn)行清洗；
(3)將芯片放置在顯微鏡下觀察捕獲的目標(biāo)細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)效果分析
(I)、如圖2所示，分別選擇區(qū)域一、區(qū)域二、區(qū)域三、區(qū)域四中的四個(gè)觀測(cè)點(diǎn)，可以看到目標(biāo)細(xì)胞在上述芯片中的分離和富集。
(2)、在上述四個(gè)區(qū)域的四個(gè)觀測(cè)點(diǎn)觀測(cè)到的目標(biāo)細(xì)胞的分布可以看出，目標(biāo)細(xì)胞的分離和富集是由于目標(biāo)細(xì)胞的尺寸和楔形溝道的尺寸相互作用的結(jié)果，大尺寸細(xì)胞富集在離出口遠(yuǎn)處，小尺寸細(xì)胞富集在離出口近處。
(3)、本實(shí)驗(yàn)?zāi)軐?shí)現(xiàn)不同尺寸的目標(biāo)細(xì)胞的分離、捕獲，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)。
(4)、本實(shí)驗(yàn)裝置使用的楔形微流體細(xì)胞捕獲芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于制作、成本低廉， 能夠?qū)Σ煌叽绾途哂刑禺愋苑肿颖磉_(dá)的細(xì)胞進(jìn)行快速高效分離、富集。
本發(fā)明采用非侵入式方式從患者提取人體液體樣本，將人體液體樣本從微溝道芯片的入口注入，由于微溝道的高度呈楔形分布，目標(biāo)細(xì)胞在溝道中通過(guò)時(shí)將實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分離和富集。本發(fā)明的微流體細(xì)胞捕獲芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于制作、成本低廉，能夠?qū)Σ煌叽绾途哂刑禺愋苑肿颖磉_(dá)的細(xì)胞進(jìn)行快速高效分離、富集。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。8
權(quán)利要求
1.一種微流體細(xì)胞捕獲芯片，其包括上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料之間形成有一條溝道，所述溝道具有入口和出口，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料至少一個(gè)是透明的材料，其特征在于，所述溝道從入口到出口的高度由高向低逐漸過(guò)渡且呈楔形或者溝道部分區(qū)域呈楔形，所述溝道最低處接近或小于至少一種目標(biāo)細(xì)胞尺寸。
2.如權(quán)利要求I所述的微流體細(xì)胞捕獲芯片，其特征在于所述溝道的寬度為O.05 200毫米，長(zhǎng)度為I 500毫米。
3.如權(quán)利要求I所述的微流體細(xì)胞捕獲芯片，其特征在于所述溝道的上下底面沉積一層納米顆粒層或納米纖維層或用于增加細(xì)胞與接觸面間摩擦阻力的微納結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求3所述的微流體細(xì)胞捕獲芯片，其特征在于所述納米顆粒層或納米纖維層為納米Ti02、SiO2或者Fe203。
5.如權(quán)利要求I或4所述的微流體細(xì)胞捕獲芯片，其特征在于對(duì)所述上部硬質(zhì)材料或者下部硬質(zhì)材料的至少一個(gè)表面進(jìn)行免疫修飾，能夠至少對(duì)一種目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分子特異性識(shí)別。
6.如權(quán)利要求I所述的微流體細(xì)胞捕獲芯片，其特征在于在所述溝道的入口處，在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料之間塞有厚度為5(Γ200微米厚的鋼片，在所述溝道的出口處，在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料之間塞有厚度為廣50微米厚的鋼片，所述溝道在所述兩塊鋼片之間形成。
7.如權(quán)利要求I所述的微流體細(xì)胞捕獲芯片，其特征在于所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料均為玻璃或者亞克力材料。
8.一種微流體細(xì)胞捕獲芯片的制作方法，其特征在于，其包括如下步驟 步驟一、將上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料重疊在一起； 步驟二、在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料重疊的一端塞入厚鋼片并用夾具壓緊，在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料重疊的另一端塞入薄鋼片并用夾具壓緊，從而在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料中間形成楔形溝道； 步驟三、在所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料的側(cè)邊用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，使人體液體樣本不能從所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料的側(cè)邊流出； 步驟四、所述楔形溝道的兩端也用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，在厚鋼片處設(shè)置通孔以形成所述楔形溝道的入口，在薄鋼片處設(shè)置通孔以形成所述楔形溝道的出口，人體液體樣本能從所述楔形溝道的入口流入，并從所述楔形溝道的出口流出。
9.如權(quán)利要求8所述的制作方法，其特征在于進(jìn)一步包括步驟五、在所述楔形結(jié)構(gòu)的入口和出口分別插上能使人體液體樣本通過(guò)的孔針。
10.如權(quán)利要求8所述的制作方法，其特征在于厚鋼片的厚度為5(Γ200微米，薄鋼片的厚度為廣50微米。
11.如權(quán)利要求8所述的制作方法，其特征在于所述溝道的寬度為O.05 200毫米，長(zhǎng)度為I 500毫米。
12.如權(quán)利要求8所述的制作方法，其特征在于在步驟一中，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料的表面沉積一層納米顆粒層或納米纖維層或有利于增加細(xì)胞與接觸面摩擦力的微納結(jié)構(gòu)。
13.如權(quán)利要求12所述的制作方法，其特征在于所述納米顆粒層或納米纖維層為納米 Ti02、SiO2 或者 Fe2O3 =
14.如權(quán)利要求8所述的制作方法，其特征在于對(duì)所述上部硬質(zhì)材料或者下部硬質(zhì)材料的至少一個(gè)表面進(jìn)行免疫修飾，能夠至少對(duì)一種目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分子特異性識(shí)別。
15.如權(quán)利要求14所述的制作方法，其特征在于對(duì)所述至少一個(gè)表面進(jìn)行修飾步驟為步驟一、用無(wú)水乙醇配制4%的3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液，將其注滿芯片溝道，在常溫下反應(yīng)I小時(shí)后用無(wú)水乙醇沖洗5分鐘；步驟二、用二甲亞砜將蛋白質(zhì)交聯(lián)劑4-馬來(lái)酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯配制成I μ mol/mL的溶液，再將其注入芯片溝道，在常溫下反應(yīng)45min后用無(wú)水乙醇沖洗5分鐘；步驟三、用磷酸鹽緩沖液配制50 μ g/mL的鏈霉親和素溶液，再將其注入芯片溝道，然后置入4°C冰箱中過(guò)夜反應(yīng)后用pH=7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗5分鐘；步驟四、將上皮細(xì)胞黏附因子抗體溶液注入芯片溝道，并在常溫下靜置反應(yīng)1-2小時(shí)后用PBS將溝道沖洗5分鐘。
16.如權(quán)利要求8所述的制作方法，其特征在于所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料均為玻璃或者亞克力材料。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求8-16任意一項(xiàng)制作方法制作出來(lái)的微流體細(xì)胞捕獲芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微流體細(xì)胞捕獲芯片，其包括上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料之間形成有一條溝道，所述溝道具有入口和出口，所述上部硬質(zhì)材料和下部硬質(zhì)材料至少一個(gè)是透明的材料，所述溝道從入口到出口的高度由高向低逐漸過(guò)渡且呈楔形或者溝道部分區(qū)域呈楔形，所述溝道最低處接近或小于至少一種目標(biāo)細(xì)胞尺寸。本發(fā)明還涉及一種微流體細(xì)胞捕獲芯片的制作方法。本發(fā)明的微流體細(xì)胞捕獲芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于制作，成本低廉，能夠?qū)Σ煌叽绾途哂刑禺愋苑肿颖磉_(dá)的細(xì)胞進(jìn)行快速高效分離、富集。
文檔編號(hào)C12M1/00GK102925337SQ20121044263
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者劉侃, 汪勝祥, 張南剛, 周鵬飛 申請(qǐng)人:武漢友芝友生物制藥有限公司