專利名稱：二聚和三聚核酸染料以及相關的系統(tǒng)和方法
二聚和三聚核酸染料以及相關的系統(tǒng)和方法本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/US2006/009910，國際申請日為2006年3月17日，進入中國國家階段的申請?zhí)枮?00680008515. X、發(fā)明名稱為“二聚和三聚核酸染料以及相關的系統(tǒng)和方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。相關申請的交叉引用本申請要求2005年3月17日Mao等提交的名為“Dimeric and TrimericNucleicAcid Dyes, and Associated Systems and Methods (二聚和三聚核酸染料以及相關系統(tǒng)和 方法)”的美國臨時申請?zhí)?0/663，613的優(yōu)先權，本申請與2006年3月16日與本文同時提交的待批美國申請?zhí)栍嘘P，該待批申請也要求美國臨時申請?zhí)?0/663，613的優(yōu)先權。上述各份臨時申請和上述申請全文納入本文作為參考。對關于合作研究協(xié)議雙方名稱的聲明Biotium, Inc. (Hay ward,加利福尼亞(CA))和 AlleLogic Biosciences Corp.(Hay ward,加利福尼亞)是涉及本發(fā)明的合作研究協(xié)議的雙方。序列表和請求書的參考，二者納為參考上述美國臨時申請?zhí)?0/663，613提交了含本文公開的SEQ ID NO: I到SEQIDNO: 10序列表的原始ASCII軟盤和作為該原始軟盤副本的另一張ASCII軟盤以及該序列表的紙件，該臨時申請涉及這些軟盤和紙件并將其全文(包括其內容)納入作為參考。同時提交了該序列表的紙件。據(jù)此要求上述美國臨時申請?zhí)?0/663，613已存檔的符合規(guī)定的(compliant)計算機可讀序列表可用于本申請。本申請序列表的紙件或光盤及其內容與上述美國臨時申請?zhí)?0/663，613所提交的序列表計算機可讀副本一致。美國臨時申請?zhí)?0/663，613的序列表，同時提交的該序列表紙件和已存檔的計算機可讀序列表全文(包括其內容)納入本文作為參考。背景熒光染料已用于檢測和分析生物學樣品。由于熒光染料靈敏度高，可利用它們來檢測非常少量的熒光分子?？衫眠@種熒光染料檢測與細胞相關的不到50個熒光分子。Barak 等，J. Cell Biol. 90，595 (1981)。可用熒光染料作為使活細胞或組織樣品成像的探針。例如，利用與網(wǎng)柄菌細胞表面受體結合的熒光染料探針使熒光標記的單分子CAMP成像。Ueda等，Science294,864(2001)?？衫镁哂胁煌瑹晒獠ㄩL的幾種熒光探針在活細胞或組織樣品中進行多色成像。與放射性探針相比，熒光探針靈敏度高，毒性較低并易于處理?？捎脽晒馊玖蠙z測核酸(包括DNA和RNA)及含核酸的生物學樣品。核酸聚合物，例如DNA和RNA參與將遺傳信息從一代傳遞至下一代，以及參與活體的常規(guī)機能。因此，核酸令人感興趣并成為研究目標。能特異性結合核酸并形成具有高度熒光的復合物的熒光核酸是這種研究的有力工具?？衫眠@些染料檢測各種介質，例如純溶液、細胞提取物、電泳凝膠、微陣列芯片、活的或固定細胞、死細胞和環(huán)境樣品中是否存在DNA和RNA及其含量?？捎眠@些染料定量檢測實時聚合酶鏈式反應(qPCR)中的DNA，該實時聚合酶鏈式反應是基因組研究和醫(yī)學診斷中所用的技術。
聚合酶鏈式反應(PCR)是一種引物延伸反應，它提供一種在體外擴增特定核酸的方法。在PCR期間，反應溶液短時維持于96°C、60°C和72°C這3種溫度中的每一種，以分別進行解鏈或變性、退火和鏈延伸。利用能快速加熱或冷卻含反應混合物的試管的自動化熱循環(huán)儀重復這種三溫度時期30或40輪。通過重復該PCR循環(huán)，可在數(shù)小時內在一種酶促反應混合物中產(chǎn)生DNA樣品的百萬倍拷貝，從而使得研究人員能測定靶DNA的大小和序列。該DNA擴增技術已用于克隆和其它分子生物學操作。PCR的其它討論見Mullis等，MethodsEnzymol. (1987)和 Saiki 等，Science (1985)?？捎玫囊环NPCR技術是定量實時PCR(qPCR)。簡言之，qPCR的機理是以指數(shù)方式對靶DNA進行PCR擴增。通過進行PCR反應同時檢測擴增反應期間給定時間點的DNA拷貝總數(shù)，能追溯計算起始DNA物質的量。熒光DNA檢測通常是qPCR所用的一種靈敏、通用以及方便的檢測方法。qPCR中使用兩種類型的突光試劑。第一種類型以用一種或多種突光染料，或一種突光染料和一種粹 滅染料的組合標記的寡核苷酸為基礎。這些標記的寡核苷酸會在與靶序列雜交后，或雜交接著切割寡核苷酸后，以與存在的DNA量成比例的方式發(fā)出熒光。各種專利和出版物描述了寡聚熒光試劑的機理和應用。參見，例如Holland等，Proc. Natl. Acad. Sci USA(1991)；Lee 等，Nucleic Acids Res. (1993);和美國專利號 5，210，015 ;5，538，848 ;6，258，569 ;5，691，146 ;5，925，517 ;5，118，801 ;5，312，728 和 6，635，427。雖然 qPCR 的寡聚熒光試劑的優(yōu)點在于對靶序列高度特異，但它們的設計非常復雜，因而使用昂貴。qPCR所用的第二種類型的熒光試劑以通常稱為熒光核酸染料或染色劑的DNA結合熒光染料為基礎。由于熒光核酸染料是較簡單的分子，它們易于制備，因此使用廉價。它們在qPCR中的應用是用于研究實驗室的常規(guī)遺傳檢測。不是所有常規(guī)可用的熒光核酸染色劑都能用于qPCR。為適用于qPCR，理想地，熒光核酸染料應符合某些標準。首先，其在PCR和保存期間應是化學穩(wěn)定的。由于PCR在高溫下進行，所述染料應對熱穩(wěn)定。此外，由于PCR所用的Tris緩沖液的pH可從在低溫下(4°C )為堿性(pH 8. 5)，顯著變化至在高溫下為中性或微酸性，所述染料應能耐受酸或堿輔助的分解作用。其次，當存在于PCR溶液中時，所述染料不應抑制PCR過程。第三，在無DNA存在時，所述染料應沒有熒光或熒光極低，有DNA存在時，應變得有高度熒光。第四，所述染料應能吸收或發(fā)出與現(xiàn)有儀器相容的波長，所述儀器通常裝配了為以下常規(guī)熒光染料優(yōu)化的光通道(optical channel):例如FAM、J0E、VIC(Applied Biosystems,Foster City,加利福尼亞)、TAMRA、R0X、德克薩斯紅、Cy3和Cy5。第五，所述染料結合DNA時，序列偏好應低或沒有。第六，DNA-染料復合物應具有與存在的DNA含量線性相關的熒光強度?？紤]到上述標準，就不奇怪可用于qPCR的核酸結合染料極少。溴化乙錠(EB)是一種DNA染料，已用其證明了 qPCR使用簡單染料的可行性。Higuchi等，Bio-Technol10 (4) ,413(1992)。然而，EB的問題是靈敏度低和波長不理想。qPCR廣泛使用的染料是Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon (OR))的 SYBR 綠 I。Wittwer 等，Biotechniques22 (I), 130 (1997) ο SYBR綠I是環(huán)狀取代的不對稱花青染料。Zipper等，Nucleic AcidsRes. 32(12)，el03 (2004);和美國專利號 5，436，134 和 5，658，751。SYBR 綠 I 的優(yōu)點在于它能激發(fā)并發(fā)出與FAM的波長非常匹配的波長(該波長與大多數(shù)儀器相容)，以及在于結合DNA時具有高度的熒光。近年來，qPCR使用了稱為LC綠的DNA染料，雖然該染料的結構未公開。雖然LC綠染料看來具有與大多數(shù)PCR儀器常規(guī)使用的FAM光學通道相匹配的理想波長，但它的靈敏度遠低于SYBR綠I。最近，有報道說qPCR使用了稱為BEBO的DNA小溝結合劑和稱為BOXTO的相關染料,二者均是不對稱花青染料。Bengtsson等，Nucleic AcidsRes. 31(8)，e45(2003);和美國專利申請公布號2004/0132046。與LC綠相似，在靈敏度方面，BEBO和BOXTO遠遜于SYBR綠I。雖然SYBR綠I廣泛用作qPCR的DNA染料，但它仍有幾方面的不足。一個不足是SYBR綠I對PCR過程有抑制作用，從而限制了增加染料濃度可達到的最大信號強度。使用SYBR綠I的qPCR的熒光信號強度先與染料濃度成比例，直至染料濃度達到染料開始明顯抑制PCR過程之時。進一步增加染料濃度實際上會因DNA擴增減少而降低了信號強度或增加了循環(huán)數(shù)(Ct)。另一不足是在堿性條件，例如PCR緩沖液在低溫保存時的堿性條件下SYBR綠I化學不穩(wěn)定。有報道說，4°C保存在Tris緩沖液中的SYBR綠I在數(shù)天期間明顯分解，染料分解產(chǎn)物明顯是強效抑制劑。Karsai等，BioTechniques 32 (4)，790 (2002)。還有另一不足是SYBR綠I只提供一種熒光顏色。許多商品化可購得的熒光檢測儀器具有多條光學通道(FAM光學通道和其它光學通道)，因而能檢測多種熒光顏色。需要開發(fā)熒光染料或所述染料的制備或利用。概述(本發(fā)明)提供了產(chǎn)生或設計適合于有用應用(例如qPCR過程)的熒光染料的方法。該方法包括通過可彎曲且基本上中性(例如，中性或略帶電荷)的橋(bridge)連接兩個或三個單體染料。如本文所述，產(chǎn)生或設計染料的方法可開發(fā)的熒光核酸染料具有迄今為止未獲得的波長和/或其它光譜特性。(本發(fā)明)提供了適合于有用領域(例如本文所述的)的熒光染料。按照本文所述方法產(chǎn)生的二聚或三聚染料可形成發(fā)夾結構，據(jù)信該結構使得所述染料通過本文進一步描述的請求式釋放(release-on-demand)機理使核酸著色。本文所述染料可具有以下至少一種特征或所有特征假使有的話，“熒光背景”也較低(無核酸存在下的熒光)，最好沒有熒光背景；PCR抑制作用較低，最好沒有PCR抑制作用；熒光信號強度較高；和穩(wěn)定性較高。對于這些特征中的至少一種，或者對于所有這些特征，所述染料優(yōu)于現(xiàn)有染料，例如SYBR綠I (只是舉例)。本文所述染料可具有某種特性，例如波長和/或另一種光譜特性，例如迄今為止未能獲得的波長和/或光譜特性。(本發(fā)明)提供了能形成分子內二聚體或形成發(fā)夾結構的二聚和/或三聚核酸染料或染色劑。據(jù)認為，發(fā)夾形染料本身可以無熒光或熒光極低，但在有核酸存在下變得有高度熒光。據(jù)認為，染料經(jīng)中間狀態(tài)與核酸結合，其中部分染料形成開放的隨機構象。還認為染料中存在少量的這種開放的隨機構象并與發(fā)夾狀態(tài)平衡。據(jù)認為，隨著核酸含量增加，平衡可從發(fā)夾狀態(tài)向染料的核酸結合狀態(tài)偏移，因而得到的熒光信號強度基本上與核酸的存在量呈線性比例。上述機理可以稱為DNA染色的請求式釋放機理，其對于各種應用，例如定量實時PCR(qPCR)是理想的。據(jù)信，形成發(fā)夾結構可使“有效的染料濃度”低，從而使得本文所述染料對PCR過程的干擾極低，這只是解釋。因此，與以前的染料，例如SYBR綠I相比，qPCR可使用較高濃度的本文所述染料。染料濃度較高可能明顯增加DNA檢測的靈敏度。(本發(fā)明)提供了測定樣品中(是否有)核酸形成或缺乏核酸形成的方法。樣品可以含或不含靶核酸。這種方法可包括提供含樣品和熒光核酸染料的檢驗溶液(testsolution),其中所述突光核酸染料如下式所示
權利要求
1.一種具有下式的化合物
2.如權利要求I所述的化合物，其中所述橋具有下式 _L「[A1- (CH2) α -] a [A2- (CH2) 0-]b [A3- (CH2) y -] c [A4- (CH2) δ -] d [A5- (CH2) ε -]6[A6- (CH2) ζ -] f [A7- (CH2) n-] g [A8- (CH2) θ -] h [A9- (CH2) t_] J-A10-L2-其中L1和L2各自獨立為含單鍵的部分；任選含有至少一個選自N、0和S的雜原子，具有包括端點的I至約12個碳的聚亞甲基單元；或任選含有至少一個選自N、0和S的雜原子的芳基AWmma9和Altl各自獨立為核酸結合增強基團(NABEG);任選含有至少一個選自N、0和S的雜原子的支鏈烷基；或任選含有至少一個選自N、0和S的雜原子的至少一個飽和5-或6-元環(huán)； α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ和ι各自獨立為O或包括端點的I至約20的整數(shù)；和 a、b、C、d、e、f、g、h和i各自獨立為O或包括端點的I至約20的整數(shù)。
3.如權利要求2所述的化合物，其中所述橋具有下式 -(CH2) X-C (=0) NH- (CH2) α - [O- (CH2) 0 ] b- [O- (CH2) γ ] C_NH (O=C) - (CH2) χ-其中X各自獨立為選自包括端點的1-11的整數(shù)；α是選自包括端點的2至約20的整數(shù)；β和Y各自獨立為2或3 ;b是O或包括端點的I至約20的整數(shù)；和c是O或I。
4.如權利要求I所述的化合物，其中Q1和Q2是具有式II所示結構的不對稱花青染料
5.如權利要求4所述的化合物，其中該化合物具有下式
6.如權利要求I所述的化合物，其中Q1和Q2各自獨立地是具有式III的結構的吖啶染料
7.如權利要求6所述的化合物，其中所述化合物具有以下結構
8.如權利要求1-7任一項所述的化合物，其中Ψ是?；駽l—。
9.一種確定樣品中是否存在核酸的試劑盒,該試劑盒包括如權利要求1-8任一項所述的化合物；任選的緩沖液；以及關于該試劑盒使用的信息。
10.一種測定樣品中是否存在核酸的方法，該方法包括將所述核酸暴露于如權利要求1-8任一項所述的化合物，使得如果該樣品中存在核酸，則形成所述化合物和所述核酸的復合物；檢測是否存在與該復合物相關的熒光。
11.一種進行核酸擴增反應的方法，該方法包括提供含有靶標核酸、用于擴增所述靶標的必要試劑、以及如權利要求1-8任一項所述的化合物的反應混合物； 使所述反應混合物在適于形成擴增的靶標核酸的條件下進行聚合反應； 用光對反應混合物進行照射；和 檢測所述反應混合物發(fā)射的熒光，其中所述發(fā)射指示存在擴增的靶標核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了二聚體和三聚體核酸染料以及有關的系統(tǒng)和方法。這種染料可形成發(fā)夾樣結構，該結構使得所述染料通過(例如)請求式釋放機理使核酸著色。例如，這種染料在沒有核酸存在下的背景熒光低，在有核酸存在下，與核酸結合后的熒光高。本發(fā)明提供的染料可用于各種領域，例如實時PCR中的DNA定量測定。
文檔編號C12Q1/68GK102942566SQ20121044587
公開日2013年2月27日 申請日期2006年3月17日 優(yōu)先權日2005年3月17日
發(fā)明者F·毛, W·-Y·里昂, X·辛 申請人:百奧提姆股份有限公司, 阿萊羅杰克生物科學股份有限公司