專利名稱：柑橘碎葉病毒的rt-lamp檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(ReverseTranscriptionLoop-MediatedIsothermal Amplification, RT-LAMP)分子檢測方法，特別涉及ー種柑橘碎葉病毒的RT-LAMP檢測方法。
背景技術(shù)：
柑桔碎葉病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)是威 脅柑桔生產(chǎn)的重要病原之一。CTLV在我國浙江、湖南、福建和廣西等地的局部地區(qū)曾造成比較嚴重的危害。應(yīng)用和推廣無病毒柑桔苗木是CTLV防治的有效措施。目前,柑桔無病毒苗木三級繁育體系已在我國多個柑桔產(chǎn)區(qū)建立，無病毒苗木得到了大面積的推廣。為保證種苗安全，必須對采穗母本樹進行定期鑒定，并對感染病毒的良種進行脫毒處理。這必然要求快速、靈敏的病毒檢測技術(shù)。CTLV是發(fā)狀病毒屬(Capillovirus)正義單鏈RNA病毒，病毒粒子呈彎曲線狀，大小約為600 700nmX 15nm,基因組全長約6496nt, 5’端具帽子結(jié)構(gòu)，3’端具Poly(A)尾巴。目前應(yīng)用臘斯克枳橙等指示植物鑒定是CTLV檢測的常規(guī)手段之一，但其檢測周期較長(1-2年)并易受環(huán)境條件影響。血清學(xué)檢測技術(shù)大大提高了 CTLV的檢測速度，在美國、日本等國得到廣泛應(yīng)用。Kawai等還制備了 CTLV單克隆抗體用于酶聯(lián)免疫法檢測。但抗體制備不易，檢測靈敏度有待提高。而RT-PCR檢測方法以其速度快、靈敏度高、特異性好等特點受到青睞。但是，它需電泳及特殊儀器，不便于在田間大規(guī)模應(yīng)用。LAMP是由Notomi于2000年開發(fā)的ー種新型的核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，借助具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行靶序列高效擴増。它避免了常規(guī)PCR溫度循環(huán)的特殊要求，并且因其高效性、簡易性、成本低廉且檢測周期短等特點，又在另ー層面上提高了它的應(yīng)用價值。目前還沒有研究建立特異、靈敏以及操作簡單的柑橘碎葉病毒RT-LAMP檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的不足之處，提供一種靈敏度高、特異性強、不需要電泳及特殊儀器的柑橘碎葉病毒RT-LAMP檢測方法，用于柑橘碎葉病毒的田間早期診斷。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為ー種柑橘碎葉病毒的RT-LAMP檢測方法，包括反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系中含有特異性引物組，其特征在于所述特異性引物組為以下四組中的任意ー組第一組omp-FIP5! -AGCTTTCGGAACGTACATTCGTAATGTTGTCCCTGAGTTGAA-3!omp-BIP
5' -CCTTTTGCTGATTTGGCTCGTGGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F3 5' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B3 5' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'；第二組omp-FIP
5' -AAGGCTCACAAAGCTTTCGGAAAACCTTTGCTGCTACTTCT-3'omp-BIP5' -TTGCTGATTTGGCTCGTGAATTGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F3 5' -AGAAAGCCAGAGAAGGGT-3'omp-B3 5' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'；第三組omp-FIP5' -GCTGAGAAGTAGCAGCAAAGGTAACTAAGATTTGGAGGATCGAC-3'omp-BIP5' -TTCCGAAAGCTTTGTGAGCCTTTTGGACCACCGTTCATG-3'omp-F3 5' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B3 5' -GTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'；第四組omp-FIP5' -ACGAAAAAGCCTCTTGGTCATTCT-AAAATGAATCGTCTAACACCTGA-3'omp-BIP5' -AAGGACAGAAAGGGGTTTTCG-TTGCGGAATTTTAAACGACTC-3'omp-F3 5' -ATTTGATTTTGCTACTGGTCT-3'omp-B3 5' -ATGTCAACCTGCAAGACC-3'。本發(fā)明利用每組特異性引物中的4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，進行靶序列高效擴增，建立了簡便、快速、成本低、靈敏度高和特異性強的CTLV環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)檢測方法，便于在田間大規(guī)?？焖賾?yīng)用。本發(fā)明的柑橘碎葉病毒的RT-LAMP檢測方法具體按照如下步驟完成(I)柑橘碎葉病病葉總RNA提取，采用Trizol法、微量抽提；(2)柑橘碎葉病的RT-LAMP擴增，配置反應(yīng)體系為25 U L,所述反應(yīng)體系中各組分的含量為 5 X Reaction Buffer [IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5%Tween 20]、6mM MgSO4U. 2mM dNTPs、0. 6M Betaine、Bst RNA 聚合酶 8U、AMV-RNA 反轉(zhuǎn)錄酶2U, IuM omp-FIP、I u M omp_BIP、0. 5 u M omp_F3、0. 5 u Momp_B3、模板 RNA I. 0 u L,加 ddH20補足，混勻，于63°C水浴鍋中反應(yīng)60-80min，之后80°C下滅活I(lǐng)Omin結(jié)束反應(yīng)；(3)反應(yīng)結(jié)束后，觀察濁度，白色渾濁即為陽性，否則為陰性；或在反應(yīng)液中加入顯色液，出現(xiàn)綠色表明為陽性，橙色則表明為陰性；0. 5 L反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜，圖譜中出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陽性，未出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陰性。在上述技術(shù)方案中，所述步驟(I)的具體操作為A、取0. Ig柑橘葉片,液氮充分研磨后加入預(yù)先放置有ImlTranzol up溶液的微型離心管中，渦旋混勻lmin，然后室溫放置5-lOmin將上述微型離心管在WOOOrpm，4°C下離心 15min ；B、取上清液Iml置于第二只微型離心管中，并在其中加入氯仿200iiL或I-溴-3-氯丙烷100 u L，用手搖15s，然后在室溫或4°C放置IOmin ；C、將第二只微型離心管在12000rpm，4°C下離心IOmin后，再取上清液650 u L加入第三只微型離心管中，加入585-650 u L的異丙醇,顛倒混勻，-20°C放置30min_lh,然后在12000rpm,4°C下離心IOmin,棄上清液,再離心15s用槍頭吸棄上清液；D、在第三只微型離心管中加入用DEPC水配制的75%的こ醇溶液1ml，該こ醇溶液的溫度為-20°C,顛倒、潤旋至混勻，然后在8000rpm,4°C下離心3min,棄上清液,再離心15s，用槍頭吸棄上清液；
E、按照步驟D的方法再洗滌一次沉淀，然后將RNA沉淀置于通風(fēng)櫥中室溫干燥 2-3min，然后加入 50 y L-100 u L DEPC 水或 DEPC 水配 I XTE 溶解 RNA，55-60 °C 孵育3-5min)，輕輕渦旋混勻，得到模板RNA溶液。有益效果本發(fā)明的RT-LAMP檢測方法具特異性強、靈敏度高、簡便快速、成本低等優(yōu)點，無需電泳及特殊儀器，便于在田間大規(guī)模應(yīng)用，該方法為CTLV病害監(jiān)測構(gòu)建了一個快速檢測的技術(shù)平臺。說明書附I為本發(fā)明特異性的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中I為第一組引物跑出來的模板RNA的特征性梯狀條帯，2為第二組引物跑出來的模板RNA的特征性梯狀條帯，3為第三組引物跑出來的模板RNA的特征性梯狀條帯，4為第四組引物跑出來的模板RNA的特征性梯狀條帶，5 為衰退病毒、類病毒(包括 CEV(裂皮病)，CBLVcU HSVcU CVd-II I、CVd-IV、CVd-OS,CVd-V、Vd-I-LSS八種病毒)、溫州蜜柑矮縮病毒以及啤酒花矮化病毒的混合樣，6為陰性對照、7 為 marker。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進ー步的說明實施例I :(I)柑橘碎葉病病葉總RNA提取，采用Trizol法、微量抽提；利用Trizol法提取柑橘基因組RNA，具體操作如下A、取0. Ig柑橘葉片，液氮充分研磨后加入預(yù)先放置有ImlTranzol up溶液的微型離心管中，渦旋混勻lmin，然后室溫放置5-10min，將上述微型離心管在12000rpm，4°C下離心 15min ；B、取上清液Iml置于第二只微型離心管中，并在其中加入氯仿200iiL或
I-溴-3-氯丙烷IOOii L，用手劇烈搖晃15s，然后在室溫或4°C放置IOmin ；C、將第二只微型離心管在12000rpm，4°C下離心IOmin后，再取上清液650 u L加入第三只微型離心管中，加入585-650 u L的異丙醇,顛倒混勻，-20°C放置30min_lh,然后在12000rpm,4°C下離心IOmin,棄上清液,再離心15s用槍頭吸棄上清液；D、在第三只微型離心管中加入用DEPC水配制的75%的こ醇溶液1ml，該こ醇溶液的溫度為-20°C,顛倒、潤旋至混勻，然后在8000rpm,4°C下離心3min,棄上清液,再離心15s，用槍頭吸棄上清液；E、按照步驟D的方法再洗滌一次沉淀，然后將RNA沉淀置于通風(fēng)櫥中室溫干燥
2-3min,然后加入 50 u L-100 u L DEPC 水或 DEPC 水配 I X TE 溶解 RNA，55-60°C孵育 3_5min，輕輕渦旋混勻，短暫離心后分裝小份，得到模板RNA溶液。該RNA溶液可在-20°C保存或-80°C長久保存。(2)柑橘碎葉病的RT-LAMP擴增,配置反應(yīng)體系為25 ii L,所述反應(yīng)體系中各組分的含量為 5 X Reaction Buffer [IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5%Tween 20]、6mM MgSO4U. 2mM dNTPs、0. 6M Betaine、Bst RNA 聚合酶 8U、AMV-RNA 反轉(zhuǎn)錄酶2U，第一組特異性引物中的 omp-FIP IuM,omp-BIP liiM 、omp_F3 0. 5 y M、omp_B3 0. 5 u M,模板RNA l.OuL,加ddH20補足，混勻。均于63°C水浴鍋中反應(yīng)60_80min，之后80°C下滅活I(lǐng)Omin結(jié)束反應(yīng),其中第一組引物中的omp-FIP、omp-BIP、omp-F3、omp-B3的堿基序列為omp-FIP5' -AGCTTTCGGAACGTACATTCGTAATGTTGTCCCTGAGTTGAA-3'omp-BIP5' -CCTTTTGCTGATTTGGCTCGTGGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F35' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B35' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'。此次實驗用樣品 I 來表示。(3)將步驟(2)反應(yīng)體系不變，只是將其中的特異性引物組換為第二組特異性引物組，它們的堿基序列為omp-FIP5' -AAGGCTCACAAAGCTTTCGGAAAACCTTTGCTGCTACTTCT-3'omp-BIP5' -TTGCTGATTTGGCTCGTGAATTGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F3 5' -AGAAAGCCAGAGAAGGGT-3'omp-B3 5' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3';重復(fù)步驟(2)的實驗。將此次實驗結(jié)果作為樣品2。(4)仍然是將步驟(2)反應(yīng)體系不變，只是將其中的第一組特異性引物組換為第三組特異性引物組，它們的堿基序列為omp-FIP5' -GCTGAGAAGTAGCAGCAAAGGTAACTAAGATTTGGAGGATCGAC-3'omp-BIP5' -TTCCGAAAGCTTTGTGAGCCTTTTGGACCACCGTTCATG-3'omp-F3 5' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B3 5' -GTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'。重復(fù)步驟(2)的實驗。將此次實驗結(jié)果作為樣品3。(5)仍然是將步驟(2)反應(yīng)體系不變，只是將其中的第一組特異性引物組換為第四組特異性引物組，它們的堿基序列為omp-FIP5' -ACGAAAAAGCCTCTTGGTCATTCT-AAAATGAATCGTCTAA CACCTGA-3'omp-BIP5' -AAGGACAGAAAGGGGTTTTCG-TTGCGGAATTTTAAACGACTC-3'omp-F3 5' -ATTTGATTTTGCTACTGGTCT-3'
omp-B3 5' -ATGTCAACCTGCAAGACC-3'。重復(fù)步驟(2)的實驗。將此次實驗結(jié)果作為樣品4。(6)同時以陰性樣品(樣品6)和marker (樣品7)作為對照，重復(fù)步驟⑵的實驗。(7)反應(yīng)結(jié)束后，觀察濁度，樣品1-4出現(xiàn)白色渾濁即為陽性；樣品6和7沒有出現(xiàn)白色渾濁為陰性?；蛟诟鞣磻?yīng)液中加入顯色液SYBR GREEN I (1000*)，樣品1_4出現(xiàn)綠色表明為陽性，樣品6-7橙色則表明為陰性；或取0. 5 2微升各個反應(yīng)液進瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜如圖I所示，圖譜中樣品1-4出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陽性，樣品6 -7未出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陰性。同樣，我們將陰性樣品和marker作為對照重復(fù)步驟3-5的實驗，均未出現(xiàn)白色渾濁，用顯色液顯色也均為橙色，用瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜也未出現(xiàn)特征性梯狀條帶。通過NCBI進行對比，反應(yīng)區(qū)域特異，僅有蘋果莖溝病與柑橘碎葉病同源性較高。且用該RT-LAMP方法分別以柑橘衰退病、類病毒(包括CEV (裂皮病)，CBLVd, HSVd,CVd-III, CVd-IV、CVd-OS, CVd-V, Vd-I-LSS八種病毒)、溫州蜜柑矮縮病、啤酒花矮化病毒等柑橘病害的RNA為模板，或者將它們的RNA混合作為模板，同樣以陰性樣品和水做負對照及空白對照，用以上四組特異性引物分別進行RT-LAMP特異性檢測，結(jié)果表明，只有CTLV樣品為陽性，對照組均為陰性，說明該方法特異性強；另外，通過采用碎葉病外殼蛋白菌液進行稀釋比對，進行了 RT-LAMP和普通PCR的靈敏度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-LAMP的靈敏度明顯強于 RT-PCR。
權(quán)利要求
1.一種柑橘碎葉病毒的RT-LAMP檢測方法，包括反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系中含有特異性引物組，其特征在于所述特異性引物組為以下四組中的任意一組 第一組omp-FIP5' -AGCTTTCGGAACGTACATTCGTAATGTTGTCCCTGAGTTGkk-3'omp-BIP 5' -CCTTTTGCTGATTTGGCTCGTGGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F35' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B35' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'； 第二組omp-FIP5' -AAGGCTCACAAAGCTTTCGGAAAACCTTTGCTGCTACTTCT-3/omp-BIP5' -TTGCTGATTTGGCTCGTGAATTGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F35' -AGAAAGCCAGAGAAGGGT-3'omp-B35' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'； 第三組omp-FIP5' -GCTGAGAAGTAGCAGCAAAGGTAACTAAGATTTGGAGGATCGAC-3'omp-BIP5' -TTCCGAAAGCTTTGTGAGCCTTTTGGACCACCGTTCATG-3'omp-F35' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B 35' -GTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'； 第四組omp-FIP5' -ACGAAAAAGCCTCTTGGTCATTCT-AAAATGAATCGTCTAACACCTGA-3'omp-BIP5' -AAGGACAGAAAGGGGTTTTCG-TTGCGGAATTTTAAACGACTC-3'omp-F35' -ATTTGATTTTGCTACTGGTCT-3'omp-B35' -ATGTCAACCTGCAAGACC-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述柑橘碎葉病毒的RT-LAMP檢測方法，其特征在于按照如下步驟完成 (1)柑橘碎葉病病葉總RNA提取，采用Trizol法、微量抽提； (2)柑橘碎葉病的RT-LAMP擴增，配置反應(yīng)體系為25μ L，所述反應(yīng)體系中各組分的含量為 5XReaction Buffer[IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5 %Tween 20]、6mM MgSO4U. 2mM dNTPs、0. 6M Betaine、Bst RNA 聚合酶 8U、AMV-RNA 反轉(zhuǎn)錄酶2U，權(quán)利要求I中的任意一組特異性引物組，引物組中的omp-FIP I μ M、omp-BIP I μ Μ、omp-F30. 5 μ M、omp-B30. 5 μ Μ、模板 RNA I. O μ L，加 ddH20 補足，混勻，于 63°C水浴鍋中反應(yīng)60-80min,之后80°C下滅活I(lǐng)Omin結(jié)束反應(yīng)； (3)反應(yīng)結(jié)束后，觀察濁度，白色渾濁即為陽性，否則為陰性；或在反應(yīng)液中加入顯色液，出現(xiàn)綠色表明為陽性，橙色則表明為陰性；或用O. 5 2μ L反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜，圖譜中出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陽性，未出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陰性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述柑橘碎葉病毒的RT-LAMP檢測方法，其特征在于所述步驟(I)的具體操作為 Α、取O. Ig柑橘葉片，液氮充分研磨后加入預(yù)先放置有ImlTranzol up溶液的微型離心管中，渦旋混勻lmin，然后室溫放置5-10min將上述微型離心管在12000rpm，4°C下離心15min ； B、取上清液Iml置于第二只微型離心管中，并在其中加入氯仿200μ L或I-溴-3-氯丙烷100 μ L，用手搖15s，然后在室溫或4°C放置IOmin ； C、將第二只微型離心管在12000rpm，4°C下離心IOmin后，再取上清液650μ L加入第三只微型離心管中，加入585-650 μ L的異丙醇，顛倒混勻，_20°C放置30min_lh,然后在12000rpm,4°C下離心IOmin,棄上清液,再離心15s用槍頭吸棄上清液； D、在第三只微型離心管中加入用DEPC水配制的75%的乙醇溶液1ml，該乙醇溶液的溫度為-20°C,顛倒、潤旋至混勻,然后在8000rpm,4°C下離心3min,棄上清液,再離心15s,用槍頭吸棄上清液；E、按照步驟D的方法再洗滌一次沉淀，然后將RNA沉淀置于通風(fēng)櫥中室溫干燥2-3min，然后加入50 μ L-100 μ L DEPC水或DEPC水配I X TE溶解RNA，55-60°C孵育·3-5min)，輕輕渦旋混勻，得到模板RNA溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種柑橘碎葉病毒的RT-LAMP檢測方法，包括反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系中含有特異性引物組，并給出了四組不同的特異性引物組，該方法具特異性強、靈敏度高、簡便快速、成本低等優(yōu)點，無需電泳及特殊儀器，便于在實驗室和田間快速檢測，該方法為柑橘碎葉病監(jiān)測構(gòu)建一個快速檢測的技術(shù)平臺。
文檔編號C12Q1/68GK102952899SQ20121045079
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者段碩, 周常勇, 李敏, 宋震, 李中安 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所