專利名稱：窖泥細(xì)菌的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及窖泥細(xì)菌的鑒定方法。
背景技術(shù)：
窖泥微生態(tài)系統(tǒng)是由厭氧異養(yǎng)菌、甲烷菌、已酸菌、乳酸菌、硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌等多種微生物組成的共生群落系統(tǒng)?！鞍倌昀辖选逼鋵?shí)質(zhì)是窖泥中富集了大量以細(xì)菌為主的多種微生物菌群，經(jīng)過長期不斷的馴化及代謝產(chǎn)物的積累，產(chǎn)生了以已酸乙酯為主體的香氣成分，為濃香型白酒帶來了獨(dú)特風(fēng)味。窖泥質(zhì)量的好壞直接對(duì)酒質(zhì)起關(guān)鍵性作用，因此窖泥微生態(tài)系統(tǒng)中的微生物的選育及鑒定，對(duì)新窖老熟及進(jìn)一步培養(yǎng)出優(yōu)質(zhì)窖泥，提高濃香型白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量提供技術(shù)支撐?！?br> MicroStation快速微生物鑒定儀,可鑒定超過2000種好氧菌、厭氧菌和酵母菌，還可以進(jìn)行霉菌的鑒定。該系統(tǒng)為美國FDA認(rèn)可，適用于任何規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室中，由于使用了方便的讀數(shù)儀，非常節(jié)省勞動(dòng)力。自Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀問世以來，在微生物的鑒定上發(fā)揮了重大作用。該儀器的原理是利用固定在微孔板上的不同生化試驗(yàn)(檢測待鑒定微生物對(duì)眾多碳源的利用情況)對(duì)微生物提供表型概況并進(jìn)行鑒定，Biolog鑒定系統(tǒng)MicroStation中的軟件通過讀取微孔板上所表現(xiàn)出的“表型指紋”被用來在種的水平上鑒定該微生物。采用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定時(shí),純的培養(yǎng)物是鑒定的前提。在鑒定中最普遍的問題是技術(shù)人員可能沒有意識(shí)到他們獲得的并非純的培養(yǎng)物，而是混合培養(yǎng)物。如果需要鑒定的微生物不純，而該系統(tǒng)本身無提示性，且系統(tǒng)仍然把它當(dāng)純種微生物對(duì)待，根據(jù)碳源的利用情況來判別就會(huì)給出錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果。窖泥中很多細(xì)菌能分泌粘液，具有粘性的表面，它們很容易和其它細(xì)菌緊緊的黏在一起，而窖泥中細(xì)菌種類繁多，通過一般的分離純化得到純的單菌株非常困難。白酒業(yè)是中國傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，釀酒窖池中窖泥細(xì)菌的分離鑒定對(duì)于揭秘中國傳統(tǒng)白酒微量香味物質(zhì)生成機(jī)理具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。所以尋找一種快速、準(zhǔn)確鑒定窖泥細(xì)菌的方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種窖泥細(xì)菌的鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是窖泥細(xì)菌的鑒定方法，包括如下步驟I)獲得待測菌株無菌條件下，取窖泥于含有玻璃珠的滅菌水中，ISOrpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10_6，取各稀釋度的菌液接種到分離培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)5 7天，得到單菌落；2)驗(yàn)證待測菌株是否為純化菌株提取待測菌株的基因組DNA，擴(kuò)增16s rDNA,將擴(kuò)增結(jié)果測序，若測序結(jié)果沒有重疊峰，即得到純化的待測菌株，若測序結(jié)果有重疊峰，即進(jìn)行二次純化，得到純的培養(yǎng)物；擴(kuò)增引物的序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示；3)采用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)純的細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定。
其中，步驟I)中分離培養(yǎng)基配方如下基礎(chǔ)培養(yǎng)基850mL/L，維生素溶液5mL/L，pH至6. O 6. 5 ;121°C高壓滅菌20min,冷卻至65°C,加入2%無水乙醇。其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下=KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4O. 5g/L，醋酸鈉2. Og/L,酪蛋白氨基酸 O. 5g/L，蛋白胨 O. 5g/L，酵母膏 O. 5g/L，KCL I. 5g/L，F(xiàn)eCl2 · 4H20 O. 002g/L，CoCl2 · 6H20 0. 0002g/L, MnCl2 · 4H20 0. 00015g/L。其中，所述維生素溶液配方如下四氨基苯甲酸酯0. 05g/L，煙酸O. lg/L，VB50. lg/L, VB60. 15g/L，VB10. 15g/L ;濾膜過濾，_20°C保存。在分離培養(yǎng)基中添加維生素溶液能給很多難于培養(yǎng)的厭氧微生物帶來微量營養(yǎng)物質(zhì)，使它們生長或是更好的生長，這樣分離效果更好。其中，步驟2)所述的二次純化包括如下操作無菌條件下，接種待純化菌株于含有玻珠的滅菌水中，180rpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10_6，取各稀釋度的菌液接種到二次純化培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)5 7天，得到單菌落；所述二次純化培養(yǎng)基為在分離培養(yǎng)基中添加20%的窖泥浸出液和5%的脫脂羊血得到。其中，所述的窖泥浸出液的制備方法如下取20年以上窖齡的窖底泥，加水，小火煮30min,過濾,定容；定容比例為每50g窖底泥定容至1L。本發(fā)明方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在使用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定前，對(duì)待測菌株進(jìn)行純化鑒定，以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明方法還針對(duì)窖泥細(xì)菌的特點(diǎn)，提出了專用的分離培養(yǎng)基，輔助提高鑒定效果。本發(fā)明為窖泥細(xì)菌的鑒定提供了新的選擇，在釀酒領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖I、16s rDNA擴(kuò)增的瓊脂糖電泳圖，圖中M代表Marker (康為世紀(jì)公司，DM2000)
圖2、I號(hào)單菌落的16s rDNA擴(kuò)增后測序峰3、2號(hào)單菌落的16s rDNA擴(kuò)增后測序峰4、3號(hào)單菌落的16s rDNA擴(kuò)增后測序峰5、4號(hào)單菌落的16s rDNA擴(kuò)增后測序峰圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的窖泥細(xì)菌的鑒定方法，包括如下步驟I)獲得待測菌株無菌條件下，取窖泥于含有玻璃珠(其作用是為了有利于窖泥分散，使菌株從窖泥中溶到水中，玻璃珠的直徑約5mm)的滅菌水中，180rpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10_6，取各稀釋度的菌液接種到分離培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)5 7天,得到單菌落；2)驗(yàn)證待測菌株是否為純化菌株提取待測菌株的基因組DNA，擴(kuò)增16s rDNA,將擴(kuò)增結(jié)果測序，若測序結(jié)果沒有重疊峰，即得到純化的待測菌株，若測序結(jié)果有重疊峰，即進(jìn)行二次純化，得到純的培養(yǎng)物；擴(kuò)增引物為27F :AGAGT TTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID Nol)和 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID No 2)。在DNA測序過程中,測定的是每一個(gè)堿基。DNA分子的每一位點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)堿基,這是通過測序儀器測定的每一峰值來確定該位點(diǎn)為何種堿基。若同一位點(diǎn)對(duì)應(yīng)多個(gè)峰或者有交叉，即為重疊峰，則說明待測樣品中的DNA分子不純，從而導(dǎo)致同一位點(diǎn)測出多種堿基的峰值。在細(xì)菌中16s rDNA高度保守，若出現(xiàn)重疊峰則說明所擴(kuò)增出來的16s rDNA不純，可能來自非同一菌株。3)采用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)純的細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定。其中，步驟I)中分離培養(yǎng)基配方如下基礎(chǔ)培養(yǎng)基850mL/L，維生素溶液5mL/L，pH至6. O 6. 5 ;121°C高壓滅菌20min,冷卻至65°C,加入2%無水乙醇。其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下=KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4O. 5g/L，醋酸鈉2. Og/L,酪蛋白氨基酸 O. 5g/L，蛋白胨 O. 5g/L，酵母膏 O. 5g/L，KCL I. 5g/L，F(xiàn)eCl2 · 4H20 O. 002g/L，CoCl2 · 6H20 0. 0002g/L, MnCl2 · 4H20 0. 00015g/L。本發(fā)明中，根據(jù)窖泥細(xì)菌的特點(diǎn)，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，得到了現(xiàn)有的針對(duì)窖泥細(xì)菌分離的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方。其中，所述維生素溶液配方如下四氨基苯甲酸酯O. 05g/L，煙酸O. lg/L,VB50. lg/L, VB60. 15g/L，VB10. 15g/L ;濾膜過濾，_20°C保存。在分離培養(yǎng)基中添加維生素溶液能給很多難于培養(yǎng)的厭氧微生物帶來微量營養(yǎng)物質(zhì)，使它們生長或是更好的生長，這樣分離效果更好。其中，步驟2)所述的二次純化包括如下操作無菌條件下，接種待純化菌株于含有玻珠的滅菌水中，180rpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到106，取各稀釋度的菌液接種到二次純化培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)5 7天，得到單菌落；所述二次純化培養(yǎng)基為在分離培養(yǎng)基中添加20%的窖泥浸出液和5%的脫脂羊血得到。其中，所述的窖泥浸出液的制備方法如下取20年以上窖齡的窖底泥，加水，小火煮30min，過濾，定容；定容比例為每50g窖底泥定容至1L。因窖泥浸出液中富含大量適合窖泥細(xì)菌生長微量因子，適量加入有利于微生物的生長，可促進(jìn)微生物的分離。
實(shí)施例I、獲得待鑒定菌株無菌條件下取10克窖泥于裝有90mL無菌水并放有玻珠的250mL三角瓶中，置搖床上180rpm室溫振蕩30分鐘。取菌液按10倍的梯度稀釋到10_6，取各稀釋度菌液ImL放入無菌平皿中，倒入滅菌后冷卻至50°C的分離培養(yǎng)基，混勻，待凝固后放入37°C厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 7天，挑取平皿中單菌落備用。選取4個(gè)待鑒定單菌落用于后續(xù)鑒定，編號(hào)1、2、
3、4。所使用的分類培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基850mL/L (KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4O. 5g/L，醋酸鈉2. Og/L,酪蛋白氨基酸0. 5g/L，蛋白胨O. 5g/L，酵母膏O. 5g/L，KCL I. 5g/L，F(xiàn)eCl2. 4Η200· 002g/L, CoCl2. 6H20 0. 0002g/L, MnCl2. 4H20 0. 00015g/L)，維生素溶液 5mL/L(四氨基苯甲酸酯 O. 05g/L，煙酸 O. lg/L, VB50. lg/L, VB60. 15g/L，VB10. 15g/L ;濾膜過濾)，pH至6. 0 6. 5 ; 121°C高壓滅菌20min,冷卻至65°C,加入2%無水乙醇。2、驗(yàn)證待測菌株是否為純化菌株(I)待測菌株總DNA提取，使用TIANGEN BIOTECH的DNA提取試劑盒(貨號(hào)DP302，下述用到試劑都是該試劑盒中提供的)·
I)菌液制備挑取單菌落于相應(yīng)的液體窖泥細(xì)菌篩選培養(yǎng)基(5ml/試管)中，放入35 37°C厭氧恒溫培養(yǎng)f 2天。待菌液渾濁，則可用于基因組DNA的提取。。2)取細(xì)菌培養(yǎng)液約5ml，IOOOOrpm離心lmin，盡量吸凈上清。3)向菌體沉淀中加入200uL緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。4)向管中加入20uL蛋白酶K溶液，混勻。5)加入220uL緩沖液GB，振蕩15s，70°C放置lOmin，溶液變清亮，簡短離心以去除
管蓋內(nèi)壁的水珠。6)加220uL無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以
去除管蓋內(nèi)壁的水珠。7)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30s，倒掉非也，將吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500uL緩沖液⑶，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。9)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。10)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。11)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附柱材料中殘余的漂洗液。12)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加5(T200ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2 5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中，
4°C保存。13)基因組DNA檢測DNA的完整性用I. O %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。首先用I X TAE (配方如下Tris base 40mM/L> Acetic acid glacial 20mM/L> EDTA ImM/L)配制1%的瓊脂糖凝膠，加熱溶解，待冷卻至5(T60°C時(shí)倒入膠模板中，使凝膠聚合。然后將4 μ L樣品與I μ L加樣緩沖液混勻后，注入加樣孔中。電泳緩沖液為1ΧΤΑΕ，電壓160V，電泳時(shí)間40min。電泳結(jié)束后將膠放在EB (O. 5 μ g/mL)中染色約lOmin。采用Syngene G:Box HRGel Documentation凝膠成相系統(tǒng)拍照。(2)目的片段(16s rDNA) PCR 擴(kuò)增I)擴(kuò)增引物用細(xì)菌通用引物27f_1492r，具體序列如下27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID No I)1492R GGTTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID No 2)2 )反應(yīng)體系(50uL )見表I。表I反應(yīng)體系
H3 允許的最終濃度范圍~
無菌超純水-34. 5 μ L
~10XPCR Buffer~6μΤ
權(quán)利要求
1.窖泥細(xì)菌的鑒定方法，其特征在于包括如下步驟 O獲得待測菌株無菌條件下，取窖泥于含有玻璃珠的滅菌水中，ISOrpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10_6，取各稀釋度的菌液接種到分離培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)5 7天,得到單菌落； 2)驗(yàn)證待測菌株是否為純化菌株；提取待測菌株的基因組DNA，擴(kuò)增16srDNA，將擴(kuò)增結(jié)果測序，若測序結(jié)果沒有重疊峰，即得到純化的待測菌株，若測序結(jié)果有重疊峰，即進(jìn)行二次純化，得到純的培養(yǎng)物；擴(kuò)增引物的序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示； 3)采用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)純的細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的窖泥細(xì)菌的鑒定方法，其特征在于步驟I)中分離培養(yǎng)基配方如下基礎(chǔ)培養(yǎng)基850mL/L，維生素溶液5mL/L，pH至6. O 6. 5 ;121°C高壓滅菌20min，冷卻至65°C，加入2%無水乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的窖泥細(xì)菌的鑒定方法，其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下=KH2PO4L 5g/L，(NH4)2SO4O. 5g/L，醋酸鈉2. Og/L，酪蛋白氨基酸O. 5g/L，蛋白胨O.5g/L,酵母膏 O. 5g/L, KCL I. 5g/L, FeCl2 · 4H20 O. 002g/L, CoCl2 · 6H20 0. 0002g/L,MnCl2 · 4H200. 00015g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的窖泥細(xì)菌的鑒定方法，其特征在于所述維生素溶液的配方如下四氨基苯甲酸酯 O. 05g/L，煙酸 O. lg/L，VB50. lg/L，VB60. 15g/L，VB10. 15g/L ;濾膜過濾，_20°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的窖泥細(xì)菌的鑒定方法，其特征在于步驟2)所述的二次純化包括如下操作無菌條件下，接種待純化菌株于含有玻珠的滅菌水中，ISOrpm室溫振蕩30分鐘，按10倍的梯度將菌液稀釋到10_6，取各稀釋度的菌液接種到二次純化培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)5 7天，得到單菌落；所述二次純化培養(yǎng)基為在分離培養(yǎng)基中添加20%的窖泥浸出液和3 5%的脫脂羊血得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的窖泥細(xì)菌的鑒定方法，其特征在于取20年以上窖齡的窖底泥，加水，小火煮30min,過濾,定容；定容比例為每50g窖底泥定容至1L。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及窖泥細(xì)菌的鑒定方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種窖泥細(xì)菌的鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是窖泥細(xì)菌的鑒定方法，包括如下步驟1)獲得待測菌株；2)驗(yàn)證待測菌株是否為純化菌株；3)采用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)純的細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定。本發(fā)明方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為窖泥細(xì)菌的鑒定提供了新的選擇，在釀酒領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102912032SQ20121045132
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者徐占成, 唐清蘭, 劉孟華, 徐姿靜, 樊科權(quán) 申請人:四川綿竹劍南春酒廠有限公司