專利名稱：Cfhr1基因型、高密度脂蛋白上cfhr1及氧化磷酸膽堿的測定試劑盒及測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白I (CFHRl)的基因型鑒定，CFHRl在血漿中的測定方法，含CFHRl高密度脂蛋白樣顆粒的分離純化，CFHRl對氧化特異性抗原的結(jié)合，以及高密度脂蛋白(HDL)上氧化磷脂的檢測，并且通過以上檢測所得到的數(shù)據(jù)，對年齡相關(guān)性黃斑變性進(jìn)行預(yù)警性診斷和治療指導(dǎo)。具體涉及有關(guān)的定量檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的發(fā)病機(jī)理涉?zhèn)€體的遺傳變異及環(huán)境危險因素(如氧化應(yīng)激)的相互作用。AMD患者視力的嚴(yán)重?fù)p失大多是由于脈絡(luò)膜新生血管(CNV)出血及滲出，或濕性AMD引起。AMD是老年人不可逆失明的主要原因并影響世界上數(shù)以百萬的人。
全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)可有效推進(jìn)基于分子水平的復(fù)雜性狀疾病1的研究。但是，對遺傳變異的性狀與發(fā)病機(jī)制之間的理解仍需實(shí)質(zhì)性的突破?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)AMD的發(fā)生與 I號染色體上的補(bǔ)體因子H (CFH)區(qū)域密切相關(guān)。CFH區(qū)域包含兩個主要疾病風(fēng)險單體，一個由rsl061170 (Y402H)標(biāo)記，另一個由rs227470(T9標(biāo)記。這兩個風(fēng)險單體型一起出現(xiàn)在60%以上的AMD患者中。
最近的研究發(fā)現(xiàn)，CFH相關(guān)蛋白(CFHRs)的拷貝數(shù)變異也與AMD相關(guān)。特別是，由 rs6677604標(biāo)記的CFHRl在高密度脂蛋白上的缺失與避免AMD1tu2病變有關(guān)。CFHRl基因位于I號染色體長臂31-32區(qū)域，其蛋白編碼與CFH的C端具有高度同源性。CFHRs與補(bǔ)體系統(tǒng)中的其它具體效應(yīng)因子相互結(jié)合起調(diào)節(jié)功能。
研究表明，許多老化疾病與氧化應(yīng)激相關(guān)，包括動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏病和 AMD1m90除了全身整體性的氧化應(yīng)激，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞同時還因?yàn)榕c局部氧化產(chǎn)物的接觸所受到氧化應(yīng)激。視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞含有大量不飽和脂肪酸磷脂，如磷脂酰膽堿(PtC)等。 這些磷脂是極容易受到氧化應(yīng)激導(dǎo)致化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生各種氧化磷脂(oxPLs)。例如 l-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PAPC, I-掠櫚酉先 ~2~ 花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿)是最常見視網(wǎng)膜磷脂之一。在氧化作用下，其中的雙鍵結(jié)構(gòu)被打斷，從而使磷酸膽堿(PC)基團(tuán)產(chǎn)生構(gòu)象變化，變?yōu)閘-palmitoyl_2-(5’ -oxo-valeroyl )-snglycero-3-phosphocholine(POVPC, I-棕櫚酰 _2_ 氧化戍酰 _sn_ 甘油-3-磷酸膽堿) (圖I)。POVPC可以由鼠天然抗體TEPC15 (通常也叫T15)明確識別。相比之下，TEPC-15卻不與正常細(xì)胞膜或天然脂蛋白上的非氧化卵磷脂結(jié)合20。通常，oxPLs存在于氧化修飾的低密度脂蛋白(oxLDL)載體或凋亡細(xì)胞上。很多研究已經(jīng)表明oxPL能夠刺激強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，并且可以作為一個可靠的氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物21’22。
有研究人員發(fā)現(xiàn)，一部分的CFHRl存在于血漿中一種特殊的高密度脂蛋白樣顆粒上。該顆粒包含載脂蛋白A (ΑροΑΙ)、脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)和磷脂23。由于此高密度脂蛋白樣顆粒僅占小于HDL總量的1%，因此推測它不是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)組件。相反，它可能具有調(diào)節(jié)功能，可能是參與和細(xì)菌內(nèi)毒素的結(jié)合來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。然而，CFHRl在此高密度脂蛋白樣顆粒中的確切作用尚沒有被充分探討，尤其是在AMD的研究中。
研究者已經(jīng)在AMD患者的視網(wǎng)膜玻璃膜疣和Bruch膜中檢測到了被氧化修飾的蛋白質(zhì)和脂24。作為天然防御機(jī)制的一部分，CFHRs可能參與這種氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)。有報道稱CFHRl缺失(CFHRl Δ )對于AMD風(fēng)險有保護(hù)作用1CU1。但是，其對于AMD風(fēng)險的影響機(jī)制在很大程度上還是未知的。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供用于從DNA模板中擴(kuò)增CFHRl基因片段的引物對。
本發(fā)明的技術(shù)方案是用于從DNA模板中擴(kuò)增CFHRl基因片段的引物對，包括標(biāo)記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座CFHRl擴(kuò)增引物對
上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3 ’( SEQ ID No 1)
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了用于對標(biāo)記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座進(jìn)行基因型鑒定的引物，其核苷酸序列
5’-TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。該引物主要是將上述CFHRl擴(kuò)增引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，以測得CFHRl上標(biāo)記為rs6677604的 SNP基因座的序列，進(jìn)而得到樣本的基因型。
本發(fā)明要解決的一個技術(shù)問題是提供一種用于鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H 相關(guān)蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒，該試劑盒包含下列成分
a、從人組織樣本中提取DNA模板的試劑；
b、用于從DNA模板中擴(kuò)增CFHRl基因片段的引物，包括擴(kuò)增標(biāo)記為rs6677604的 CFHRl擴(kuò)增引物對
上游引物:5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQID No 1)
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
C、用于對DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷進(jìn)行基因型鑒定的引物序列，包括標(biāo)記為 rs6677604的CFHRl基因型鑒定的引物序列
5， -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。
其中，上述試劑盒中所述的人組織樣本為外周血樣本。
本發(fā)明提供的標(biāo)記為rs6677604的CFHRl擴(kuò)增引物對可應(yīng)用于制備鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒。
本發(fā)明提供的標(biāo)記為rs6677604的CFHRl基因型鑒定的引物可應(yīng)用于制備鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒。
本發(fā)明提供的鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒可用于檢測年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)患者CFHRl基因型。
本發(fā)明還提供了一種鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白1 (CFHRl)基因型的方法，該方法包括以下步驟
a、從人組織樣本中提取和純化DNA模板；
b、利用DNA模板擴(kuò)增補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白1 (CFHR1)基因片段，采用的擴(kuò)增引物為rs6677604標(biāo)記的CFHRl擴(kuò)增引物對
上游引物5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQID No I)；
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
C、使用基因型鑒定的引物序列對步驟b得到的補(bǔ)體因子H的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增， 得到的產(chǎn)物測序進(jìn)行基因型SNP鑒定，如果其中保護(hù)性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為AA ;其中如果致病性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為GG ;其中如果保護(hù)性/致病性等位基因?yàn)殡s合子標(biāo)記為AG。
其中所述的基因型鑒定的引物為 5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAA TGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。
本發(fā)明還提供了一種測定血漿中CFHRl含量的免疫印跡試劑盒，該試劑盒包含下列成分
a、抗 CFHRl 的抗體；
b、CFHRI 標(biāo)準(zhǔn)品。
其中用于制備抗CFHRl抗體的多肽為CPTVQNAHILSRQMS (SEQ ID No 4)。
其中所述抗CFHRl的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段中的任一種。
本發(fā)明還提供了測定血漿中CFHRl含量的方法，包括以下步驟
a、將血漿樣本進(jìn)行SDS電泳；
b、將電泳分離后的膠轉(zhuǎn)印至尼龍薄膜；
C、使抗CFHRl抗體與薄膜上的蛋白結(jié)合；
d、測定所述抗體與CFHRl的結(jié)合量。
其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素一親和素系統(tǒng)測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來檢測所述抗體與 CFHRl的結(jié)合量。
其中，上述方法中還可包括步驟e，即根據(jù)以CFHRl標(biāo)準(zhǔn)品測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定血漿中的CFHRl量。
本發(fā)明還提供一種從血漿中分離純化含CFHRl的高密度脂蛋白的試劑盒，該試劑盒包含下列成分溴化鉀，比重計，離心管和透析膜。
本發(fā)明還提供一種從血漿中分離純化含CFHRl的高密度脂蛋白的方法，該方法包括以下步驟
a、將外周血進(jìn)行血漿分離
b、用溴化鉀將血漿調(diào)整至I. 027克/毫升
c,45,000RPM 離心 18 小時
d、丟棄上層液后，提取中層液體
e、用溴化鉀將其調(diào)整至I. 065克/毫升
f、45，000RPM 離心 18 小時
g、上層液體，放入透析袋；
h、用PBS透析后測定蛋白濃度
本發(fā)明還提供了一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結(jié)合量的試劑盒，該試劑盒包含下列成分
a、抗載脂蛋白Al抗體，用于將血漿中高密度脂蛋白樣顆粒俘獲；
b、抗CFHRl的抗體，用于與含高密度脂蛋白樣顆粒的樣品接觸。
其中用于制備抗CFHRl抗體的多肽序列為CPTVQNAHILSRQMS (SEQ ID No 4)。
其中所述抗CFHRl的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段中的任一種。
本發(fā)明同時提供了一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結(jié)合量的方法，包括以下步驟
a、用抗載脂蛋白Al抗體將血漿中高密度脂蛋白俘獲；
b、將抗CFHRl的抗體與含高密度脂蛋白樣顆粒的樣品接觸；
C、使抗CFHRl的抗體與其中的CFHRl結(jié)合；
d、測定抗CFHRl的抗體與CFHRl的結(jié)合量。
其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素一親和素系統(tǒng)測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來檢測所述抗體與 CFHRl的結(jié)合量。
為了使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，可以通過使用純化的CFHRl標(biāo)準(zhǔn)品與抗CFHRl的抗體制備得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來獲得待測樣品中高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結(jié)合量。因此，上述方法中還可包括步驟e，即根據(jù)以CFHRl標(biāo)準(zhǔn)品測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定氧化高密度脂蛋白樣顆粒表面的CFHRl量。
本發(fā)明提供了一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的試劑盒，該試劑盒包含下列成分
a、抗載脂蛋白Al抗體，用于將血漿中高密度脂蛋白樣顆粒俘獲；
b、抗磷酸膽堿的抗體，用于與含高密度脂蛋白樣顆粒的樣品接觸。
其中，上述試劑盒中所述抗磷酸膽堿的抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V-kappa 22VL輕鏈可變區(qū)。
本發(fā)明同時提供了一種定量檢測含高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的方法，包括以下步驟
a、用抗載脂蛋白Al抗體將血漿中高密度脂蛋白俘獲；
b、將抗磷酸膽堿的抗體與高密度脂蛋白的樣品接觸；
C、使所述抗磷酸膽堿的抗體與氧化磷酸膽堿結(jié)合；
d、測定所述抗磷酸膽堿的抗體與氧化磷酸膽堿的結(jié)合量。
其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素一親和素系統(tǒng)測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來檢測所述抗體與氧化磷酸膽堿的結(jié)合量。
其中，上述方法還可包括步驟e，即根據(jù)以磷酸膽堿化合物為標(biāo)準(zhǔn)品測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定氧化高密度脂蛋白表面的氧化特異抗原決定簇的量。
其中，上述方法中所述的抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V-kappa 22VL輕鏈可變區(qū)。
其中，上述方法中所述的含有氧化高密度脂蛋白樣品為血清、血漿、組織勻漿液或組織提取液。
本發(fā)明還提供一種定量測定補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白I與氧化特異性抗原結(jié)合的試劑盒，該試劑盒含有下列成分
a、含POVPC的氧化特異性抗原；
b、抗 CFHRl 的抗體。
本發(fā)明同時提供一種定量測定補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白I與氧化特異性抗原結(jié)合的方法，包含下列操作步驟
a、制備含POVPC的氧化特異性抗原；
b、包被氧化特異性抗原在微孔板上；
C、將血漿中CFHRl與氧化特異性抗原結(jié)合；
d、用抗CFHRl的抗體測定CFHRl與氧化特異性抗原的結(jié)合量。
其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素一親和素系統(tǒng)測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來檢測所述CFHRl與氧化特異性抗原的結(jié)合量。
其中，上述方法還可包括步驟e，即根據(jù)以CFHRl為標(biāo)準(zhǔn)品測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定 CFHRl與氧化特異性抗原的結(jié)合量。
本發(fā)明中CFHRl標(biāo)準(zhǔn)品可采用以下方式獲得將CFHRl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核生物體外表達(dá)系統(tǒng)，該質(zhì)粒表達(dá)后，然后通過親和層析純化得到CFHRl標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明中外周血基因組DNA的提取與純化，可以通過本領(lǐng)域熟知的生物工程方法制備，可使用Qiagen公司的血液DNA純化試劑盒。
在本發(fā)明的定量檢測含高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的方法中，所述抗載脂蛋白Al抗體和抗磷酸膽堿的抗體可從市場上購買也可通過本領(lǐng)域熟知的生物工程方法制備。例如，購自Sigma化學(xué)公司的抗人體ApoAI抗體Anti-humanApoAI(HDL)和TEPC15 即可用做本發(fā)明方法中的抗體。此外，可以用常規(guī)免疫學(xué)方法制備抗載脂蛋白Al抗體(即用純化人載脂蛋白B注射山羊制備抗血清純化IgG的方法)，或者用生物工程方法制備抗磷酸膽堿的抗體，優(yōu)選編碼所述抗磷酸膽堿的抗體的基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V-kappa 22VL輕鏈可變區(qū)。在檢測過程中，為了使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，可以通過不同量的磷酸膽堿化合物標(biāo)準(zhǔn)品與抗磷酸膽堿的抗體的結(jié)合獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定氧化高密度脂蛋白表面的氧化特異抗原決定簇的量。
在本發(fā)明中“磷酸膽堿”(Phosphocholine)指的是磷脂酰膽堿(卵磷脂)的兩條脂肪酸尾巴被去掉后所余下的結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明的檢測抗原與抗體結(jié)合量的方法基于抗原抗體間反應(yīng)的特異性和標(biāo)記物檢測的靈敏性，是一種免疫標(biāo)記測定方法。即采用酶、熒光劑、放射性同位素、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原抗體間的特異性反應(yīng)，從而能定量檢測抗體或抗原的量。其中將抗原特異性抗體標(biāo)記后進(jìn)行檢測的方法是直接法，采用標(biāo)記的第二抗體對檢測結(jié)果進(jìn)行放大的方法為間接法。
在本發(fā)明的方法中，采用直接化學(xué)發(fā)光免疫分析法、間接化學(xué)發(fā)光免疫分析法、直接放射免疫測定法、間接放射免疫測定法、直接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、直接生物素一親和素系統(tǒng)測定法、間接生物素一親和素系統(tǒng)測定法中的任一種來完成。而上述這些直接法和間接法又分別可進(jìn)一步地分為夾心法和非夾心法。
雙抗體夾心法可如下完成先將抗磷酸膽堿抗體固定在固相載體上，加入含有氧化低密度脂蛋白的樣品，使二者接觸，再加入抗ApoB抗體(或稱抗LDL抗體，Sigma)，使之與氧化低密度脂蛋白接觸，測定抗ApoB抗體的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量?；蛘?， 先將抗ApoB抗體固定在固相載體上，加入含有氧化低密度脂蛋白的樣品，使二者接觸，再加入抗磷酸膽堿抗體，使之與氧化低密度脂蛋白接觸，測定抗磷酸膽堿抗體的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。
本發(fā)明中的鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白I (CFHR1)基因型的試劑盒可用于檢測年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)患者CFHRl基因型。
本發(fā)明中的測定血漿樣品中CFHRl含量的試劑盒可用于檢測血漿樣品中CFHRl含量。
本發(fā)明中的從血漿中分離純化含CFHRl的高密度脂蛋白的試劑盒可用于分離純化血漿中含CFHRl的高密度脂蛋白。
本發(fā)明中的定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結(jié)合量的試劑盒可用于檢測血漿樣品中高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl的結(jié)合量。
本發(fā)明中的檢測血漿樣品中高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的試劑盒可用于檢測血漿樣品中高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原。
本發(fā)明中的檢測血漿樣品中CFHRl蛋白與氧化特異性抗原結(jié)合的試劑盒可用于檢測血漿樣品中CFHRl蛋白與氧化特異性抗原的結(jié)合。
本發(fā)明所述的任一試劑盒均可用于檢測年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)疾病的發(fā)生、 發(fā)展。
通過我們建立的計算公式，我們可以推斷出AMD發(fā)病的幾率。
本發(fā)明的有益效果在于創(chuàng)造性地確認(rèn)了不同基因型CFHRl通過氧化應(yīng)激影響 AMD風(fēng)險的新機(jī)制和CFHRl在這一調(diào)節(jié)過程中的作用。開發(fā)出不同基因型CFHRl的檢測試劑盒和檢測方法。這些發(fā)現(xiàn)可能會導(dǎo)致在預(yù)防和治療老年黃斑退化的新策略，如通過CFHRl 活性的抑制或?qū)ζ湎掠蔚膮⑴c脈絡(luò)膜形成炎癥基因，包括IL-I的活性抑制，以期能預(yù)防和治療老年黃斑退化。本發(fā)明的試劑盒具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖I、為天然與氧化磷脂的結(jié)構(gòu)圖
IA為天然的磷酸膽堿的分子結(jié)構(gòu)；1B為氧化的磷酸膽堿的分子結(jié)構(gòu)，其中箭頭所指的虛線橢圓框內(nèi)所示為T15抗氧化磷脂抗體的抗原決定簇。
圖2、CFHRl缺失rs6677604基因型的鑒定圖譜
2A為純和保護(hù)性基因型(AA) ;2B為雜和基因型(AG) ;2C為純和致病性基因型 (GG)0
圖3、為高密度脂蛋白樣顆粒的組成部分
3A 為 Westernblot 檢測人血衆(zhòng)；
3B為Westernblot檢測相應(yīng)的所分離純化的高密度脂蛋白樣顆粒；
rs6677604與純合子AA基因型的樣本被標(biāo)示成“保護(hù)型”;rs6677604純合子GG基因型的樣本被標(biāo)示成“風(fēng)險型”。
3C、顯不聞密度脂蛋白樣顆粒含有氧化憐脂(oxPL);縱坐標(biāo)表不聞密度脂蛋白樣顆粒上氧化磷脂的值，數(shù)據(jù)以相對光單位(RLU)表示，平均值土SEM。
圖4、重組補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白I (rCFHRl)能夠特異性地與氧化磷脂結(jié)合
4A顯示rCFHRl能夠與POVPC - BSA，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)呈劑量依賴性結(jié)合，但卻不能夠與天然LDL和BSA結(jié)合。Nat-LDL表示非氧化的,天然的低密度脂蛋白。
4B顯示oxLDL能夠競爭性抑制rCFHRl與P0VPC-BSA的結(jié)合。將rCFHRl與不斷增加濃度的競爭劑預(yù)先預(yù)孵育，然后添加到一個包被P0VPC-BSA的微孔板，再以抗CFHRl抗體檢測結(jié)合到板上的CFHR1。數(shù)據(jù)表示為BziBtl，其中Btl是沒有競爭劑時CFHRl與抗原的結(jié)合值。圖A和B均為三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。
4C 和 4D :血漿中 oxPL (C)或 CRP (C-反應(yīng)蛋白)(D)的水平與 CFHRlrs6677604 基因型相關(guān)(CFHR1 Λ，N=8與CFHR1，N=82)。數(shù)據(jù)表示為平均相對光單位(RLU) 土SEM。
4E和4F:高密度脂蛋白樣顆粒刺激炎癥性基因表達(dá)。圖E，將保護(hù)型 (rs6677604AA, CFHRl Δ ,N=4),或風(fēng)險型(rs6677604GG，CFHRl，N=4)基因型的高密度脂蛋白樣顆粒處理的ARPE-19細(xì)胞，然后用定量PCR測定所示基因的表達(dá)。圖F表示用氧化低密度脂蛋白處理ARPE-19細(xì)胞在有無rCFHRl存在(N=4)的條件下IL-IA的表達(dá)。相對mRNA 水平用GAPDH的水平進(jìn)行調(diào)整后，相對于未經(jīng)處理的樣品進(jìn)行比對。Nat-LDL表示非氧化的，天然的低密度脂蛋白。
圖5、含CFHRl高密度脂蛋白樣顆粒促進(jìn)CNV的形成
5A和5C :視網(wǎng)膜下注射含CFHRl高密度脂蛋白樣顆粒誘導(dǎo)CNV的。用isolectin 染色(綠，5A)可以查看到新生血管性活動(箭頭)；而巨噬細(xì)胞在視網(wǎng)膜下腔的浸潤(箭頭) 則通過F4/80陽性染色(紅色，5B)觀察所確定。合并后的圖像顯示isolectin和F4/80染色標(biāo)記新生血管和巨噬細(xì)胞浸潤共存在于注射部位附近(5C)。細(xì)胞核用DAPI (藍(lán)色)反染色顯示。
5D和5E為陰性對照面板，顯示天然低密度脂蛋白注射后沒有促進(jìn)CNV新生血管的活動(5D)或巨噬細(xì)胞的浸潤(5E)。尺寸把100微米。
圖6、oxPL，載脂蛋白Al和CFHRl在AMD共同存在于患者玻璃膜疣
免疫組化顯示，當(dāng)AMD患者的眼睛切片被如下抗體免疫染色的結(jié)果無抗體(6A)， 抗oxPL抗體(6B)，抗載脂蛋白Al (60抗體，和抗0 服1抗體(60)。尺寸把50微米。
圖7、激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜CNV實(shí)驗(yàn)結(jié)果
7A表示脈絡(luò)膜新生血管(CNV)在野生型和IL-I受體敲除小鼠的面積大小比較；7B 表示脈絡(luò)膜新生血管(CNV)在野生型小鼠中加入IL-I抑制劑與沒有抑制劑的面積大小比較；
7A和7B中的縱坐標(biāo)表示新生血管面積(μ m2)
7C和7D為7A中野生型和IL-I受體敲除小鼠的面積的代表性影像；7E和7F為7B 中入IL-I抑制劑與沒有抑制劑的面積的代表性影像。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明中，最初在1560個無血緣關(guān)系的歐洲人后裔白種人個體中的CFHrsl061170C/T和CFHRl rs6677604A/G的基因分型，包括886個AMD病人和674個正常對照組。我們的研究結(jié)果表明rsl061170和rs6677604的單核苷酸多態(tài)性與AMD高度相關(guān) (ρ=4· 53Χ1(Γ16和 4· 98Χ 10,，表 I)。單核苷酸多態(tài)性rsl061170 將對missense CFH Y402H 變異編碼，并在之前顯示出與AMD強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)3’5_7。CFHRl表達(dá)是否缺失可以通過rs6677604 基因座上的SNP來檢測。若要確定是否與帶有AMD的rs6677604關(guān)聯(lián)是獨(dú)立于rsl061170， 我們執(zhí)行逐步回歸分析。即在對rs 1061170調(diào)后節(jié)，rs6677604仍然強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)AMD風(fēng)險 (p=l. 16X IO-3)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，使用來自密歇根、梅奧、AREDS、賓夕法尼亞州 (MMAP)群體研究的獨(dú)立群體(國家眼科研究所，Accession phs000182. v2. pi)來進(jìn)行同樣的分析。在MMAP的數(shù)據(jù)集中，SNP rsl0801555作為rsl061170代理SNP(r2=0. 99)9。如所料，遺傳協(xié)會MMAP數(shù)據(jù)的分析顯示，rsl0801555與AMD強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)。調(diào)節(jié)rsl0801555之后發(fā)現(xiàn)，在MMAP群集中rs6677604仍然與AMD大大相關(guān)聯(lián)(p=2. 38X 1(Γ6，表2)。同時，這些結(jié)果確定與AMD風(fēng)險與CFHRl相關(guān)聯(lián)并獨(dú)立于CFH Υ402Η。究由四川大學(xué)華西醫(yī)院和圣地亞哥加利福尼亞大學(xué)的機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)。所有參與者都提供了書面的知情同意文檔， 都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的眼部檢查，包括視力測量，擴(kuò)張狹縫燈顯微鏡、彩色攝影和熒光素眼底血管造影。濕性AMD的診斷是基于根據(jù)AREDS所設(shè)立的分類得到CNV的存在25。
表ICFH rsl061170)和CFHRl (rs6677604)的單核苷酸多態(tài)性與AMD高度相關(guān)
權(quán)利要求
1.用于從DNA模板中擴(kuò)增CFHRl基因片段的引物對，包括標(biāo)記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座CFHRl擴(kuò)增引物對，其序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示 上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3’ (SEQ ID No I)； 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)。
2.用于對標(biāo)記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座進(jìn)行基因型鑒定的引物，其序列如SEQ ID No 3 所示5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
3.權(quán)利要求I中所述的引物對在制備鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2中所述的引物在制備鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒中的應(yīng)用。
5.用于鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、從人組織樣本中提取DNA模板的試劑； b、用于從DNA模板中擴(kuò)增CFHRl基因片段的引物，包括標(biāo)記為rs6677604的CFHRl擴(kuò)增引物對，其序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示 上游引物:5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQ ID No I) 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)； c、用于對DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷進(jìn)行基因型鑒定的引物序列，包括rs6677604標(biāo)記的CFHRl基因型鑒定的引物序列，其序列如SEQ ID No 3所示5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的人組織樣本為外周血樣本。
7.鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a、從人組織樣本中提取和純化DNA模板； b、利用DNA模板擴(kuò)增CFHRl基因片段，采用的擴(kuò)增引物為標(biāo)記為rs6677604的CFHRl擴(kuò)增引物對 上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3’ (SEQ ID No I)； 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)； c、使用基因型鑒定的引物序列對步驟b得到的CFHRl的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物測序進(jìn)行基因型SNP鑒定，如果其中保護(hù)性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為AA ;其中如果致病性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為GG ;其中如果保護(hù)性/致病性等位基因?yàn)殡s合子標(biāo)記為AG ； 所述的基因型鑒定的引物序列包括rs6677604標(biāo)記的CFHRl基因型鑒定的引物序列5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
8.測定血漿中CFHRl含量的免疫印跡試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、抗CFHRl的抗體； b、Ci7HRl標(biāo)準(zhǔn)品。
9.測定血漿中CFHRl含量的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a、血漿樣本進(jìn)行SDS電泳； b、將電泳分離后的膠轉(zhuǎn)印至尼龍薄膜；C、使抗CFHRl抗體與薄膜上的蛋白結(jié)合； d、測定所述抗體與CFHRl的結(jié)合量。
10.一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結(jié)合量的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、抗載脂蛋白Al抗體； b、抗CFHRl的抗體。
11.一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上CFHRl結(jié)合量的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a、用抗載脂蛋白Al抗體將血漿中高密度脂蛋白俘獲； b、抗CFHRl的抗體與高密度脂蛋白樣顆粒樣品接觸； C、使抗CFHRl的抗體與其中的CFHRl結(jié)合； d、測定抗CFHRl的抗體與CFHRl的結(jié)合量。
12.一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、抗載脂蛋白Al抗體，用于將血漿中高密度脂蛋白樣顆粒俘獲； b、抗磷酸膽堿的抗體，用于與含高密度脂蛋白樣顆粒的樣品接觸。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于所述抗磷酸膽堿的抗體的基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V-kappa 22VL輕鏈可變區(qū)。
14.一種定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 a、用抗載脂蛋白Al抗體將血漿中高密度脂蛋白俘獲； b、抗磷酸膽堿的抗體與含高密度脂蛋白的樣品接觸； C、使抗磷酸膽堿的抗體與氧化磷酸膽堿結(jié)合； d、測定抗磷酸膽堿的抗體與氧化磷酸膽堿的結(jié)合量。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的定量檢測高密度脂蛋白樣顆粒上氧化特異性抗原的方法，其特征在于所述的含有氧化高密度脂蛋白樣品為血清、血漿、組織勻漿液或組織提取液。
16.一種定量測定CFHRl與氧化特異性抗原結(jié)合的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有下列成分 a、含POVPC的氧化特異性抗原； b、抗CFHRl的抗體。
17.一種定量測定CFHRl與氧化特異性抗原結(jié)合的方法，其特征在于包含如下步驟 a、制備含POVPC的氧化特異性抗原； b、包被氧化特異性抗原在微孔板上； C、將血漿中CFHRl與氧化特異性抗原結(jié)合； d、用抗CFHRl的抗體測定CFHRl與氧化特異性抗原的結(jié)合量。
18.根據(jù)權(quán)利要求8、10或16所述的試劑盒，其特征在于用于制備抗CFHRl的抗體的多肽的序列如SEQ ID No 4所示。
19.根據(jù)權(quán)利要求8、10或16所述的試劑盒，其特征在于所述抗CFHRl的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段中的任一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求9、11、14或17所述的方法，其特征在于所述步驟d可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素一親和素系統(tǒng)測定法、放射免疫測定法中的至少一種方法來測定所述抗體與抗原的結(jié)合量。
21.根據(jù)權(quán)利要求9、11、14或17所述的方法，其特征在于還包括步驟e，即根據(jù)以純化的CFHRl或者磷酸膽堿化合物為標(biāo)準(zhǔn)品測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定CFHRl的定量或高密度脂蛋白樣顆粒表面的氧化特異抗原決定簇的量。
全文摘要
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)疾病發(fā)生、發(fā)展的診斷試劑。本發(fā)明涉及對CFHR1基因型鑒定、血漿樣品中CFHR1含量測定、高密度脂蛋白樣顆粒上CFHR1結(jié)合量和CFHR1與氧化特異性抗原結(jié)合的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明對年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)疾病發(fā)生、發(fā)展的診斷提供了可靠的參照指標(biāo)。創(chuàng)造性地確認(rèn)了不同基因型CFHR1。而本發(fā)明的工作可能會導(dǎo)致在預(yù)防和治療老年黃斑退化的新策略，如通過CFHR1活性的抑制或?qū)ζ湎掠蔚膮⑴c脈絡(luò)膜形成炎癥基因，包括IL-1的活性抑制，以期能預(yù)防和治療老年黃斑退化。具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GK102978204SQ20121045134
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者張康, 彼得.肖 申請人:張康