游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用大孔吸附樹(shù)脂固定化對(duì)苯二酚，通過(guò)野油菜黃單胞菌（Xanthomonas?campestris）CGMCC?NO.1243游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚與雙糖合成α-熊果苷的制備方法。它包括固定化對(duì)苯二酚的制備，黃單胞菌游離細(xì)胞的制備，反應(yīng)條件優(yōu)化，游離細(xì)胞和樹(shù)脂的回收及循環(huán)使用和產(chǎn)物分離提取等工藝步驟。采用本發(fā)明生產(chǎn)α-熊果苷，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.5-95.2%，每升反應(yīng)液α-熊果苷產(chǎn)量為20-250g，比直接用游離對(duì)苯二酚作為反應(yīng)物的產(chǎn)量提高了2-15倍。此外，菌體細(xì)胞的使用壽命長(zhǎng)達(dá)5-10個(gè)周期，樹(shù)脂使用壽命達(dá)50-300個(gè)周期；產(chǎn)物經(jīng)分離純化后純度可達(dá)99.5％以上。本發(fā)明利用游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚，具有產(chǎn)量高、工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，大大降低了α-熊果苷生產(chǎn)成本。
【專利說(shuō)明】游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及利用大孔吸附樹(shù)脂固定化對(duì)苯二酚，通過(guò)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC N0.1243游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酌.與雙糖合成α-熊果苷的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]α -熊果苷具有顯著抑制酪氨酸酶的活性，可以減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對(duì)皮膚有漂白、防色變和祛斑的功效。在比較α-熊果苷與其同分異構(gòu)體β_熊果苷的美白效果時(shí)，Kazuhisa等學(xué)者發(fā)現(xiàn)α -熊果苷的美白效果是β _熊果苷的10倍以上，且對(duì)人體具有很好的安全。目前，α-熊果苷是國(guó)際公認(rèn)的并正在極力推廣的高效、安全的美白劑，是美白、祛斑、防曬化妝品理想的添加成份。
[0003]作為α-熊果苷合成反應(yīng)物之一的對(duì)苯二酚具有殺菌作用，它可以通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)巰基水平及升高活性氧水平改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)而引起細(xì)胞凋亡。當(dāng)α-熊果苷合成反應(yīng)體系中游離對(duì)苯二酚的濃度超過(guò)一定量時(shí)，會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致菌體催化能力顯著下降，不利于α-熊果苷的合成。因此，研究一種既可以提高反應(yīng)體系中對(duì)苯二酚的濃度又可以降低其毒害作用的方法，成為大規(guī)模低成本生產(chǎn)α -熊果苷的必然選擇。
[0004]固定化(immobilized)技術(shù)是用化學(xué)或物理手段將物體定位于限定空間區(qū)域的一門新興技術(shù)，在化工、發(fā)酵、能源、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用廣泛。大孔吸附樹(shù)脂是一類具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹(shù)脂，有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以通過(guò)物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)，已在環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
[0005]目前，由于利用化學(xué)合成方法很難合成α-熊果苷，所以關(guān)于α -熊果苷的制備方法主要通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法來(lái)實(shí)現(xiàn)。如今國(guó)外關(guān)于α-熊果苷合成的報(bào)道主要有Nishimura，Kitao, Kurosu, Prodanovic, Seo等；國(guó)內(nèi)主要有張鵬、李群良、姜眠、龐宗文及杜剛等。但這些方法均存在以下一些問(wèn)題:
[0006]一、催化劑(菌體或酶)對(duì)對(duì)苯二酚的耐受度不高，無(wú)有效辦法克服對(duì)苯二酚對(duì)催化劑的毒性，從而使反應(yīng)體系中的對(duì)苯二酚濃度無(wú)法提高，導(dǎo)致α -熊果苷的產(chǎn)量普遍偏低,生產(chǎn)成本高居不下；
[0007]二、催化劑使用壽命短，使用一次以后基本上就喪失了酶活力，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多次循環(huán)使用，導(dǎo)致催化劑利用率不高；
[0008]三、產(chǎn)物α -熊果苷后續(xù)分離純化工藝復(fù)雜、設(shè)備投資及操作費(fèi)用均較大；
[0009]四、生產(chǎn)過(guò)程有含對(duì)苯二酚廢水排放，導(dǎo)致環(huán)境污染。
[0010]為了克服這些問(wèn)題，利用游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α -熊果苷是很好的解決辦法。通過(guò)把對(duì)苯二酚固定在大孔吸附樹(shù)脂上，首先既可以大大提高反應(yīng)體系中對(duì)苯二酚的濃度，又可避免反應(yīng)體 系中游離對(duì)苯二酚的存在，從而避免了游離對(duì)苯二酚對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝和酶活力抑制作用，進(jìn)而極大地提高α-熊果苷的產(chǎn)量；其次，利用菌體游離細(xì)胞作為催化劑，具有多次重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，提高了催化劑利用率，節(jié)約了菌體發(fā)酵原材料成本；再者，待反應(yīng)結(jié)束后，固定在樹(shù)脂上的產(chǎn)物和未反應(yīng)的對(duì)苯二酚只需用簡(jiǎn)單過(guò)濾即可從反應(yīng)體系中分離出來(lái)，簡(jiǎn)化了后續(xù)產(chǎn)物分離純化工藝及設(shè)備投資，并減少了反應(yīng)體系對(duì)苯二酚廢水的排放，避免了對(duì)環(huán)境的污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，利用固定化對(duì)苯二酚消除對(duì)苯二酚對(duì)菌體細(xì)胞的毒害作用，提高反應(yīng)體系中對(duì)苯二酚的濃度，從而提高α-熊果苷的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)低成本大規(guī)模生產(chǎn)α-熊果苷的目的。其中固定化對(duì)苯二酚即采用大孔吸附樹(shù)脂吸附法對(duì)對(duì)苯二酚進(jìn)行固定化，并用此固定化對(duì)苯二酚作為野油菜黃單胞菌CGMCC N0.1243游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷的反應(yīng)物，在最佳反應(yīng)條件下催化合成α-熊果苷。該方法具有提高菌體對(duì)對(duì)苯二酚的耐受度，簡(jiǎn)化產(chǎn)物后續(xù)分離純化工藝，提高菌體細(xì)胞使用壽命，減少含酚廢水排放等優(yōu)點(diǎn)，大大降低了 α-熊果苷生產(chǎn)成本，為大規(guī)模低成本生產(chǎn)α-熊果苷奠定了基礎(chǔ)。
[0012]本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是:
[0013]利用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)對(duì)苯二酹進(jìn)行固定化,然后用野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris) CGMCC N0.1243的游離細(xì)胞在緩沖溶液系統(tǒng)中催化固定化對(duì)苯二酚與雙糖合成α -熊果苷，該方法由下列工藝步驟組成:
[0014](I)固定化對(duì)苯二酚的制備； [0015](2)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC N0.1243游離細(xì)胞的制備，其中包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)；
[0016](3)加入固定化對(duì)苯二酚和雙糖進(jìn)行合成反應(yīng)；
[0017](4)游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂的回收及循環(huán)使用；
[0018](5) α-熊果苷的分離純化。
[0019]本發(fā)明的具體工藝步驟及工藝條件是:
[0020]步驟(1)中固定化對(duì)苯二酚的制備:
[0021]先配制質(zhì)量百分比濃度為1-10%的對(duì)苯二酚水溶液；然后每IOOmL對(duì)苯二酚水溶液加入IOg大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行吸附，待樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡后進(jìn)行過(guò)濾；最后用蒸餾水洗凈樹(shù)脂表面殘留的對(duì)苯二酚；制得吸附量為0.1-1g對(duì)苯二酚/g樹(shù)脂的固定化對(duì)苯二酚。
[0022]步驟(2)中野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)CGMCC N0.1243 游離細(xì)胞的制備:
[0023]挑取I環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC N0.1243菌株，加入到體積為250ml的液體培養(yǎng)基中，在溫度為25-40°C，轉(zhuǎn)速為50_200r/min搖床中培養(yǎng)10_24h后得一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液按1-10%接種量接種到體積為1000升的發(fā)酵罐中，在溫度為25-40°C，轉(zhuǎn)速為50-300r/min，通風(fēng)量為0.l_2vvm條件下培養(yǎng)10_24h得二級(jí)種子液；再以1-10%接種量接種到體積為10000升發(fā)酵罐中，在溫度為25-40°C，通風(fēng)量為0.l_2vvm,轉(zhuǎn)速為50-300r/min條件下培養(yǎng)10_24h ;最后把培養(yǎng)好的發(fā)酵液進(jìn)行微濾或離心即可獲得菌體游離細(xì)胞。[0024]種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成:
[0025]雙糖10-60份，蛋白胨1-10份，酵母粉1_10份，硫酸鎂0.5-2份，磷酸氫二鐘1_3份,氣化納1-3份和水1000份。
[0026]步驟(3)中的合成反應(yīng)條件為:
[0027]往緩沖溶液中加入固定了對(duì)苯二酚的大孔吸附樹(shù)脂和雙糖，其中游離細(xì)胞質(zhì)量百分比濃度為5-20g/L，大孔吸附樹(shù)脂質(zhì)量百分比濃度為10-100g/L，雙糖的質(zhì)量百分比濃度為5-720g/L ;在反應(yīng)溫度為20-50°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50_300r/min條件下反應(yīng)24_72h。
[0028]步驟(4)中游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂的回收及循環(huán)使用:
[0029]在游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α -熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾方法即可把游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行回收，回收的細(xì)胞用緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物固定化對(duì)苯二酚和雙糖的緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243游離細(xì)胞多次催化合成α -熊果苷；在此條件下，菌體游離細(xì)胞在轉(zhuǎn)化了 5-10個(gè)周期后，細(xì)胞仍保持70%的活力。分離出來(lái)的樹(shù)脂進(jìn)入步驟(5)進(jìn)行產(chǎn)物分離純化，待產(chǎn)物分離后，樹(shù)脂重新用于對(duì)苯二酚的固定化，并再次作為反應(yīng)物投入緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，樹(shù)脂的使用壽命可達(dá)50-300個(gè)周期。
[0030]步驟(5)中α -熊果苷的分離純化包括以下三個(gè)步驟:
[0031]①將反應(yīng)完成后的反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾得到大孔吸附樹(shù)脂，然后用蒸餾水把樹(shù)脂表面的緩沖溶液洗干凈；
`[0032]②把經(jīng)過(guò)①步驟的大孔吸附樹(shù)脂用體積百分比濃度為1-90%的酒精進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；
[0033]③把經(jīng)過(guò)②步驟的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，當(dāng)濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時(shí)，放入溫度為0_4°C條件下進(jìn)行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5%以上的α-熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫度為40-60°C，結(jié)晶時(shí)間為2-12h。
[0034]本發(fā)明提供的利用大孔吸附樹(shù)脂固定化對(duì)苯二酚作為野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243游離細(xì)胞催化合成α -熊果苷反應(yīng)物的方法，適用于以非極性大孔吸附樹(shù)脂，弱極性大孔吸附樹(shù)脂，中等極性大孔吸附樹(shù)脂或極性大孔吸附樹(shù)脂為固定化介質(zhì)的固定化對(duì)苯二酚的方法。
[0035]本發(fā)明所用的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC N0.1243已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所(100080)，保藏號(hào)為野油菜黃單胞菌CGMCC N0.1243，保藏時(shí)間為2004年11月8日。
[0036]本發(fā)明所取得的技術(shù)進(jìn)步在于:
[0037]本發(fā)明是通過(guò)以固定化對(duì)苯二酹作為野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)CGMCC N0.1243催化合成α -熊果苷的反應(yīng)物，消除游離對(duì)苯二酚對(duì)菌體細(xì)胞的毒害作用，解決了反應(yīng)體系中對(duì)苯二酚濃度無(wú)法提高導(dǎo)致α-熊果苷產(chǎn)量偏低，產(chǎn)物后續(xù)分離工藝復(fù)雜，過(guò)程中有含酚廢水排放等問(wèn)題。利用本發(fā)明生產(chǎn)α-熊果苷的方法具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0038](I)產(chǎn)量高成本低:通過(guò)把對(duì)苯二酚固定在大孔吸附樹(shù)脂上，消除了反應(yīng)體系中游離對(duì)苯二酚對(duì)菌體的毒害作用，可以成倍提高反應(yīng)體系中對(duì)苯二酚的濃度，從而極大提高α -熊果苷的產(chǎn)量，降低α -熊果苷的生產(chǎn)成本，使大規(guī)模生產(chǎn)α -熊果苷成為可能；
[0039](2)催化劑使用壽命長(zhǎng):完成一批次反應(yīng)的菌體細(xì)胞依然保持很高的活力，具有循環(huán)多次使用的能力，其使用壽命長(zhǎng)達(dá)5-10個(gè)周期，大大節(jié)約了菌體發(fā)酵原材料成本；
[0040](3)產(chǎn)物分離純化工藝簡(jiǎn)單:在反應(yīng)結(jié)束后，固定在樹(shù)脂上的產(chǎn)物只需用簡(jiǎn)單的過(guò)濾方法就可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物和反應(yīng)體系有效分離，大大簡(jiǎn)化了產(chǎn)物后續(xù)分離純化工藝及其設(shè)備投資；
[0041](4)生產(chǎn)過(guò)程環(huán)境友好:在反應(yīng)結(jié)束后，未反應(yīng)的對(duì)苯二酚依然固定在樹(shù)脂上，并重新投入下一批次的反應(yīng)中去，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程沒(méi)有喊酚廢水的排放，對(duì)環(huán)境不造成任何污染。
[0042]采用本發(fā)明生產(chǎn)的α-熊果苷具有產(chǎn)量高，工藝步驟簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。在最佳反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化率達(dá)到70-95.2%，每升反應(yīng)液中α -熊果苷產(chǎn)量高達(dá)20-235g,比直接用游離對(duì)苯二酚作為反應(yīng)物(ZL200410090980.5與ZL200510080364.6)的產(chǎn)量提高了 2-15倍；產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，產(chǎn)品純度達(dá)99.5%以上。因此，本發(fā)明具有重大工業(yè)化意義。
[0043]本發(fā)明的方法涉及的非極性大孔吸附樹(shù)脂，弱極性大孔吸附樹(shù)脂，中等極性大孔吸附樹(shù)脂或極性大孔吸附樹(shù)脂，既可用公知的方法合成，也可以是市場(chǎng)銷售產(chǎn)品。作為市場(chǎng)銷售的大孔吸附樹(shù)脂的代表例子，例如下面所列舉的實(shí)施例只是為了更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受它們的任何限定。
【具體實(shí)施方式】
[0044]實(shí)施例1
[0045](I)固定化對(duì)苯二酚的制備:
[0046]先配制質(zhì)量百分比濃度為5%的對(duì)苯二酚水溶液；然后每100ml對(duì)苯二酚水溶液加入 IOg 非極性大孔吸附樹(shù)脂如 D201、D4020、D4006、D3520、H1020、H103、H107、HPD100,HPD700、PS、NKA、X-5或YWDOlB進(jìn)行吸附；待樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡后進(jìn)行過(guò)濾；最后用蒸餾水洗凈樹(shù)脂表面殘留的對(duì)苯二酚；制得吸附量為0.5g對(duì)苯二酚/g樹(shù)脂的固定化對(duì)苯二酚。
[0047](2)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243 游離細(xì)胞的制備:
[0048]挑取I環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC N0.1243菌株，加入到體積為250ml的液體培養(yǎng)基中，在溫度為35°C，轉(zhuǎn)速為150r/min搖床中培養(yǎng)15h后得一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液按5%接種量接種到體積為1000升的發(fā)酵罐中，在溫度為35°C，轉(zhuǎn)速為125r/min，通風(fēng)量為Ivvm條件下培養(yǎng)15h得二級(jí)種子液；再以5%接種量接種到體積為10000升發(fā)酵罐中，在溫度為35°C，通風(fēng)量為lwm，轉(zhuǎn)速為100r/min條件下培養(yǎng)15h ;最后把培養(yǎng)好的發(fā)酵液進(jìn)行離心即可獲得菌體游離細(xì)胞。
[0049]種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成:
[0050]蔗糖30份，蛋白胨5份，酵母粉5份，硫酸鎂1份，磷酸氫二鉀2份，氯化鈉1份和水1000份。
[0051](3)加入反應(yīng)物進(jìn)行合成反應(yīng):[0052]往磷酸緩沖溶液中加入固定了對(duì)苯二酚的大孔吸附樹(shù)脂和雙糖，其中游離細(xì)胞質(zhì)量百分比濃度為10g/L，大孔吸附樹(shù)脂質(zhì)量百分比濃度為50g/L，蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為156g/L ;在反應(yīng)溫度為35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min條件下反應(yīng)72h。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α -熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)90.8%，每升反應(yīng)液中含α -熊果苷56.lg。
[0053](4)游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂的回收及循環(huán)使用:
[0054]在游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α -熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾方法即可把游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行回收，回收的細(xì)胞用緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物固定化對(duì)苯二酚和蔗糖的磷酸緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243游離細(xì)胞多次催化合成α -熊果苷；在此條件下，菌體游離細(xì)胞在轉(zhuǎn)化了 8個(gè)周期后，α -熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為:90.8%,89.5%,86.7%,84.2%,81 78.3%,75.1 %、71.2%，對(duì)應(yīng)的 α -熊果苷質(zhì)量濃度為:56.lg/L、55.3g/L、53.6g/L、52.lg/L、50.lg/L、48.4g/L、46.4g/L、44g/L，所以游離細(xì)胞在使用8次后，細(xì)胞活力仍保持在70%以上。分離出來(lái)的樹(shù)脂進(jìn)入步驟(5)進(jìn)行產(chǎn)物分離純化，待產(chǎn)物分離后，樹(shù)脂重新用于對(duì)苯二酚的固定化，并再次作為反應(yīng)物投入緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，樹(shù)脂的使用壽命可達(dá)200個(gè)周期。
[0055](5) α -熊果苷的分離純化:
[0056]①將反應(yīng)完成后的反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾得到大孔吸附樹(shù)脂，然后用蒸餾水把樹(shù)脂表面的緩沖溶液洗干凈；
[0057]②把經(jīng)過(guò)①步驟的大孔吸附樹(shù)脂用體積百分比濃度為35%的酒精進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；
[0058]③把經(jīng)過(guò)②步驟的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，當(dāng)濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時(shí)，放入溫度為(TC條件下進(jìn)行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5%以上的α-熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫度為50°C，結(jié)晶時(shí)間為1 2h。
[0059]實(shí)施例2
[0060](I)固定化對(duì)苯二酚的制備:
[0061]先配制質(zhì)量百分比濃度為10%的對(duì)苯二酚水溶液；然后每100ml對(duì)苯二酚水溶液加入IOg極性大孔吸附樹(shù)脂如NKA-9、NKA-11、S-8、HPD600或YWD06進(jìn)行吸附；待樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡后進(jìn)行過(guò)濾；最后用蒸餾水洗凈樹(shù)脂表面殘留的對(duì)苯二酚；制得吸附量為Ig對(duì)苯二酚/g樹(shù)脂的固定化對(duì)苯二酚。
[0062](2)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243 游離細(xì)胞的制備:
[0063]挑取I環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC N0.1243菌株，加入到體積為250ml的液體培養(yǎng)基中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為100r/min搖床中培養(yǎng)15h后得一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液按10%接種量接種到體積為1000升的發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為100r/min，通風(fēng)量為1.5vvm條件下培養(yǎng)15h得二級(jí)種子液；再以10%接種量接種到體積為10000升發(fā)酵罐中，在溫度為30°C，通風(fēng)量為1.5vvm，轉(zhuǎn)速為80r/min條件下培養(yǎng)15h ;最后把培養(yǎng)好的發(fā)酵液進(jìn)行微濾即可獲得菌體游離細(xì)胞。
[0064]種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成:
[0065]蔗糖50份，蛋白胨5份，酵母粉1份，硫酸鎂0.5份，磷酸氫二鉀2份，氯化鈉2份和水1000份。
[0066](3)加入反應(yīng)物進(jìn)行合成反應(yīng):
[0067]往醋酸緩沖溶液中加入固定了對(duì)苯二酚的大孔吸附樹(shù)脂和雙糖，其中游離細(xì)胞質(zhì)量百分比濃度為20g/L，大孔吸附樹(shù)脂質(zhì)量百分比濃度為100g/L，麥芽糖的質(zhì)量百分比濃度為700g/L ;在反應(yīng)溫度為30°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min條件下反應(yīng)72h。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α -熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)92.5%，每升反應(yīng)液中含α -熊果苷228.7g。
[0068](4)游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂的回收及循環(huán)使用:
[0069]在游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α -熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾方法即可把游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行回收，回收的細(xì)胞用緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物固定化對(duì)苯二酚和蔗糖的磷酸緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243游離細(xì)胞多次催化合成α -熊果苷；在此條件下，菌體游離細(xì)胞在轉(zhuǎn)化了 5個(gè)周期后，α -熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為:92.5%,88.2 %,81.5 %,76.4 %,70.5%,對(duì)應(yīng)的 α -熊果苷質(zhì)量濃度為:228.7g/L、218.lg/L、201.5g/L、188.9g/L、174.3g/L，所以游離細(xì)胞在使用5次后，細(xì)胞活力仍保持在70%以上。分離出來(lái)的樹(shù)脂進(jìn)入步驟(5)進(jìn)行產(chǎn)物分離純化，待產(chǎn)物分離后，樹(shù)脂重新用于對(duì)苯二酚的固定化，并再次作為反應(yīng)物投入緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，樹(shù)脂的使用壽命可達(dá)100個(gè)周期。
[0070](5) α -熊果苷的分離純化:
[0071]①將反應(yīng)完成后的反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾得到大孔吸附樹(shù)脂，然后用蒸餾水把樹(shù)脂表面的緩沖溶液洗干凈；
[0072]②把經(jīng)過(guò)①步驟的大孔吸附樹(shù)脂用體積百分比濃度為35%的酒精進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；
`[0073]③把經(jīng)過(guò)②步驟的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，當(dāng)濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時(shí)，放入溫度為(TC條件下進(jìn)行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5%以上的α-熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫度為50°C，結(jié)晶時(shí)間為12h。
[0074]實(shí)施例3
[0075](I)固定化對(duì)苯二酚的制備:
[0076]先配制質(zhì)量百分比濃度為1%的對(duì)苯二酚水溶液；然后每100ml對(duì)苯二酚水溶液加入IOg弱極性大孔吸附樹(shù)脂如AB-8或YWD03F進(jìn)行吸附；待樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡后進(jìn)行過(guò)濾；最后用蒸餾水洗凈樹(shù)脂表面殘留的對(duì)苯二酚；制得吸附量為0.1g對(duì)苯二酚/g樹(shù)脂的固定化對(duì)苯二酹。
[0077](2)野油菜黃單胞菌(Xanthomonss campestris) CGMCC N0.1243 游離細(xì)胞的制備:
[0078]挑取I環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC N0.1243菌株，加入到體積為250ml的液體培養(yǎng)基中，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為200r/min搖床中培養(yǎng)IOh后得一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液按I %接種量接種到體積為1000升的發(fā)酵罐中，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為200r/min，通風(fēng)量為0.1vvm條件下培養(yǎng)24h得二級(jí)種子液；再以1%接種量接種到體積為10000升發(fā)酵罐中，在溫度為25°C，通風(fēng)量為0.lvvm，轉(zhuǎn)速為150r/min條件下培養(yǎng)24h ;最后把培養(yǎng)好的發(fā)酵液進(jìn)行離心即可獲得菌體游離細(xì)胞。[0079]種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成:
[0080]蔗糖10份，蛋白胨10份，酵母粉10份，硫酸鎂1份，磷酸氫二鉀3份，氯化鈉1份和水1000份。
[0081](3)加入反應(yīng)物進(jìn)行合成反應(yīng):
[0082]往檸檬酸緩沖溶液中加入固定了對(duì)苯二酚的大孔吸附樹(shù)脂和雙糖，其中游離細(xì)胞質(zhì)量百分比濃度為10g/L，大孔吸附樹(shù)脂質(zhì)量百分比濃度為100g/L，乳糖的質(zhì)量百分比濃度為63g/L ;在反應(yīng)溫度為25°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50r/min條件下反應(yīng)48h。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)95.2%，每升反應(yīng)液中含α-熊果苷23.5g。
[0083](4)游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂的回收及循環(huán)使用:
[0084]在游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α -熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾方法即可把游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行回收，回收的細(xì)胞用緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物固定化對(duì)苯二酚和蔗糖的磷酸緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243游離細(xì)胞多次催化合成α -熊果苷；在此條件下，菌體游離細(xì)胞在轉(zhuǎn)化了 10個(gè)周期后，α -熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為:95.2%,94.8%,93.5%,92.3%,91.2%,90.5%,87.8%,85.1%,83.6%,81.2%，對(duì)應(yīng)的 α -熊果苷質(zhì)量濃度為:23.5g/L、23.4g/L、23.lg/L,22.8g/L、22.6g/L、22.4g/L、21.7g/L、21g/L、20.7g/L、20.lg/L，所以游離細(xì)胞在使用10次后，細(xì)胞活力仍保持在80%以上。分離出來(lái)的樹(shù)脂進(jìn)入步驟(5)進(jìn)行產(chǎn)物分離純化，待產(chǎn)物分離后，樹(shù)脂重新用于對(duì)苯二酚的固定化，并再次作為反應(yīng)物投入緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，樹(shù)脂的使用壽命可達(dá)300個(gè)周期。
[0085](5) α -熊果苷的分離純化:
[0086]①將反應(yīng)完成后的反應(yīng)液進(jìn)`行過(guò)濾得到大孔吸附樹(shù)脂，然后用蒸餾水把樹(shù)脂表面的緩沖溶液洗干凈；
[0087]②把經(jīng)過(guò)①步驟的大孔吸附樹(shù)脂用體積百分比濃度為35%的酒精進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；
[0088]③把經(jīng)過(guò)②步驟的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，當(dāng)濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時(shí)，放入溫度為(TC條件下進(jìn)行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5%以上的α-熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫度為50°C，結(jié)晶時(shí)間為12h。
[0089]實(shí)施例4
[0090](I)固定化對(duì)苯二酚的制備:
[0091]先配制質(zhì)量百分比濃度為5%的對(duì)苯二酚水溶液；然后每100ml對(duì)苯二酚水溶液加入IOg中等極性大孔吸附樹(shù)脂如HPD-450或YWD04進(jìn)行吸附；待樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡后進(jìn)行過(guò)濾；最后用蒸餾水洗凈樹(shù)脂表面殘留的對(duì)苯二酚；制得吸附量為0.5g對(duì)苯二酚/g樹(shù)脂的固定化對(duì)苯二酚。
[0092](2)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243 游離細(xì)胞的制備:
[0093]挑取I環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC N0.1243菌株，加入到體積為250ml的液體培養(yǎng)基中，在溫度為40°C，轉(zhuǎn)速為300r/min搖床中培養(yǎng)IOh后得一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液按5%接種量接種到體積為1000升的發(fā)酵罐中，在溫度為40°C，轉(zhuǎn)速為50r/min，通風(fēng)量為2vvm條件下培養(yǎng)IOh得二級(jí)種子液；再以5%接種量接種到體積為10000升發(fā)酵罐中，在溫度為40°C，通風(fēng)量為2vvm，轉(zhuǎn)速為50r/min條件下培養(yǎng)15h ;最后把培養(yǎng)好的發(fā)酵液進(jìn)行微濾即可獲得菌體游離細(xì)胞。
[0094]種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成:
[0095]蔗糖60份，蛋白胨5份，酵母粉5份，硫酸鎂2份，磷酸氫二鉀1份，氯化鈉3份和水1000份。
[0096](3)加入反應(yīng)物進(jìn)行合成反應(yīng):
[0097]往硼酸緩沖溶液中加入固定了對(duì)苯二酚的大孔吸附樹(shù)脂和雙糖，其中游離細(xì)胞質(zhì)量百分比濃度為10g/L，大孔吸附樹(shù)脂質(zhì)量百分比濃度為25g/L，蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為78g/L ;在反應(yīng)溫度為40°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min條件下反應(yīng)72h。在此反應(yīng)條件下，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)93.5%，每升反應(yīng)液中含0-熊果苷28.98。
[0098](4)游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂的回收及循環(huán)使用:
[0099]在游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α -熊果苷反應(yīng)結(jié)束后，利用過(guò)濾方法即可把游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行回收，回收的細(xì)胞用緩沖溶液洗滌2-3次，再次投入含有反應(yīng)物固定化對(duì)苯二酚和蔗糖的磷酸緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCC N0.1243游離細(xì)胞多次催化合成α -熊果苷；在此條件下，菌體游離細(xì)胞在轉(zhuǎn)化了 9個(gè)周期后，α -熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為:93.5%,92.8%、89.5%、85.9%、83.5%、81.3%、77.5%、73.3%、70.5%，對(duì)應(yīng)的 α -熊果苷質(zhì)量濃度為:28.9g/L、28.7g/L、27.7g/L、26.6g/L、25.8g/L、25.lg/L、24g/L、22.7g/L、21.8g/L，所以游離細(xì)胞在使用9次后 ，細(xì)胞活力仍保持在70%以上。分離出來(lái)的樹(shù)脂進(jìn)入步驟(5)進(jìn)行產(chǎn)物分離純化，待產(chǎn)物分離后，樹(shù)脂重新用于對(duì)苯二酚的固定化，并再次作為反應(yīng)物投入緩沖溶液體系中進(jìn)行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，樹(shù)脂的使用壽命可達(dá)250個(gè)周期。
[0100](5) α -熊果苷的分離純化:
[0101]①將反應(yīng)完成后的反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾得到大孔吸附樹(shù)脂，然后用蒸餾水把樹(shù)脂表面的緩沖溶液洗干凈；
[0102]②把經(jīng)過(guò)①步驟的大孔吸附樹(shù)脂用體積百分比濃度為35%的酒精進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；
[0103]③把經(jīng)過(guò)②步驟的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，當(dāng)濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時(shí)，放入溫度為(TC條件下進(jìn)行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5%以上的α-熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫度為50°C，結(jié)晶時(shí)間為12h。
【權(quán)利要求】
1.游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)對(duì)苯二酹進(jìn)行固定化，然后用野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) CGMCCN0.1243游離細(xì)胞在緩沖溶液系統(tǒng)中催化固定化對(duì)苯二酚與雙糖合成α -熊果苷，該方法由下列工藝步驟組成: (O固定化對(duì)苯二酹的制備； (2)野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris) CGMCC N0.1243游離細(xì)胞的制備,其中包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)； (3)加入固定化對(duì)苯二酚和雙糖進(jìn)行合成反應(yīng)； (4)游離細(xì)胞和大孔吸附樹(shù)脂的回收及循環(huán)使用； (5)α-熊果苷的分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:所述的(I)步驟中固定化對(duì)苯二酚的制備是利用大孔吸附樹(shù)脂吸附法制備，其步驟是:先配制質(zhì)量百分比濃度為1-10%的對(duì)苯二酚水溶液；然后每IOOmL對(duì)苯二酚水溶液加入IOg大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行吸附，待樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡后進(jìn)行過(guò)濾；最后用蒸餾水洗凈樹(shù)脂表面殘留的對(duì)苯二酚；制得吸附量為0.1-1g對(duì)苯二酚/g樹(shù)脂的固定化對(duì)苯二酚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:所述的用于固定化對(duì)苯二酚的大孔吸附樹(shù)脂為非極性大孔吸附樹(shù)脂，弱極性大孔吸附樹(shù)脂，中等極性大孔吸附樹(shù)脂或極性大孔吸附樹(shù)脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:所述的(2)步驟中的種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成:雙糖10-60份，蛋白胨1-10份，酵母粉1-10份，硫酸鎂0.5-2份，磷酸氫二鉀1-3份，氯化鈉1_3份和水1000份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:種子液培養(yǎng)的工藝條件為培養(yǎng)溫度為25-40°C，搖床轉(zhuǎn)速為50-200r/min，發(fā)酵時(shí)間為10_24h ;發(fā)酵液培養(yǎng)的工藝條件為種子液接種量為1_10%，培養(yǎng)溫度為25-40°C，通風(fēng)量為0.l-2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為50-300r/min，發(fā)酵時(shí)間為10_24h ;把培養(yǎng)后的發(fā)酵液進(jìn)行微濾或離心即可獲得菌體游離細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:所述的(3)步驟中的反應(yīng)條件為:在一定體積的緩沖溶液中，游離細(xì)胞質(zhì)量百分比濃度為5-20g/L，固定化了對(duì)苯二酚的大孔吸附樹(shù)脂質(zhì)量百分比濃度為10-100g/L，雙糖的質(zhì)量百分比濃度為5-720g/L，反應(yīng)溫度為20-50°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50_300r/min，反應(yīng)時(shí)間為24-72h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:所述的緩沖溶液為磷酸緩沖溶液，醋酸緩沖溶液，檸檬酸緩沖溶液，碳酸緩沖溶液，硼酸緩沖溶液，巴比妥酸緩沖溶液或三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:所述的雙糖為蔗糖，麥芽糖或乳糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:所述的(4)步驟中的游離細(xì)胞的使用壽命為5-10個(gè)周期，固定化對(duì)苯二酚的大孔吸附樹(shù)脂的使用壽命為50-300個(gè)周期。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離細(xì)胞催化固定化對(duì)苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于:所述的(5)步驟中的α -熊果苷的分離純化包括以下三個(gè)步驟: ①將反應(yīng)完成后的反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾得到大孔吸附樹(shù)脂，然后用蒸餾水把樹(shù)脂表面的緩沖溶液洗干凈； ②把經(jīng)過(guò)①步驟的大孔吸附樹(shù)脂用體積百分比濃度為1-90%的酒精進(jìn)行洗脫，收集洗脫液； ③把經(jīng)過(guò)②步驟的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，當(dāng)濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時(shí)，放入溫度為0-4°C條件下進(jìn)行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5%以上的α -熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫 度為40-60°C，結(jié)晶時(shí)間為2-12h。
【文檔編號(hào)】C12R1/64GK103805657SQ201210452208
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月13日
【發(fā)明者】王芳, 劉春巧, 鄧?yán)? 張鵬, 張淑榮, 譚天偉, 聶開(kāi)立, 劉珞, 趙鵬凱 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)