專利名稱：一種重組熱帶假絲酵母生產(chǎn)木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組熱帶假絲酵母工程菌的構(gòu)建及其在全細(xì)胞法生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木糖醇(英文名xylitol,化學(xué)名稱1，2，3，4，5_pentahydroxypetane),又稱戍五醇。木糖醇作為木糖代謝的中間產(chǎn)物之一，是一種天然存在的五碳糖醇。木糖醇是一種高甜度低熱量的天然植物甜味劑，是一種高附加值的多元醇。木糖醇具有非致齲性，其在體內(nèi)代謝不依賴胰島素，并具有保肝護(hù)肝的作用，被廣泛應(yīng)用于口腔衛(wèi)生、醫(yī)藥產(chǎn)品、食品添加劑等工業(yè)領(lǐng)域中。
目前已商品化的木糖醇生產(chǎn)都是采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法。先將來源于不同生物質(zhì)原料的半纖維素經(jīng)酸或堿水解處理，使其中的多縮戊糖水解為D-木糖，然后經(jīng)過復(fù)雜的脫毒、脫色等工序去除有害雜質(zhì)，再在鎳催化劑作用下將水解液中的木糖進(jìn)行加氫還原獲得木糖醇?；瘜W(xué)法生產(chǎn)木糖醇產(chǎn)量低，在生產(chǎn)過程中需要高溫高壓，最后的催化液中成分復(fù)雜，木糖醇的提取純化比較困難。整個(gè)木糖醇生產(chǎn)工藝復(fù)雜，能耗高、污水排放量高，生產(chǎn)成本高，嚴(yán)重限制了木糖醇的生產(chǎn)和應(yīng)用。微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇條件溫和，而且具有專一性好、轉(zhuǎn)化效率高、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，是替代化學(xué)法生產(chǎn)的理想途徑。一般來說，酵母被認(rèn)為是最好的木糖醇轉(zhuǎn)化微生物。目前用于生產(chǎn)木糖醇的酵母菌株包括能夠代謝木糖的天然酵母菌，以及利用樹干畢赤氏酵母(Pichiastipitis)的木糖還原酶基因(XYLl)構(gòu)建的重組釀酒酵母菌。這些酵母菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇時(shí)，其底物木糖仍要通過硫酸或堿水解半纖維素原料獲得，工藝過程仍需排放大量廢水，受到國家環(huán)保指標(biāo)的嚴(yán)格限制。同時(shí)，硫酸或堿水解半纖維素原料獲得的水解液中，往往含有苯酚、糠醛等毒性物質(zhì)及其他抗?fàn)I養(yǎng)因子，對酵母細(xì)胞的生長具有極大的毒害作用，進(jìn)而影響菌株發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的能力。因此，直接以半纖維素原料為底物，采用全細(xì)胞法清潔生產(chǎn)木糖醇成為未來木糖醇工業(yè)發(fā)展的必然趨勢，能夠解決半生物合成法的高能耗、高排污的行業(yè)問題，以實(shí)現(xiàn)過程的節(jié)能減排，推動(dòng)生物質(zhì)資源利用整體技術(shù)進(jìn)步。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種利用重組熱帶假絲酵母全細(xì)胞法生產(chǎn)木糖醇的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種重組熱帶假絲酵母工程菌株，分別克隆木聚糖酶(XYN)和木糖苷酶(XYL)編碼基因，利用分子生物學(xué)技術(shù)將這兩條基因片段的完整表達(dá)盒導(dǎo)入酵母表達(dá)載體PAUR123中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAUR123-Xyn-Xyl后轉(zhuǎn)入木糖利用型熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)中得到工程菌株。本發(fā)明的重組熱帶假絲酵母菌株C. tropicalis PNL能共表達(dá)木聚糖酶和木糖苷酶,這兩種酶均為胞外分泌型,活性高。該重組菌能直接利用玉米芯半纖維素為底物，實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞法生產(chǎn)木糖醇，減少了環(huán)境污染。所述重組的熱帶假絲酵母菌株C. tropicalis PNL在全細(xì)胞法生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用。(I)菌體種子液的制備在搖瓶中按10-50%的裝液量加入種子培養(yǎng)基，所用種子培養(yǎng)基配方為木糖(5_50gL)、蛋白胨(I-IOgL)、酵母膏(l-10g/L)、K2HPO4(l_5g/L)、MgSO4 · 7H20 (O. 1-0. 5g/L)、CaCl2 (0. 1-0. 5g/L)，pH4. 5-6. 5，在 100-130°C下滅菌 10_30min后，在無菌條件下從活化平板上挑取C. tropicalis PNL單菌落接入上述搖瓶中，培養(yǎng)溫度為30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速為150-300rpm，培養(yǎng)時(shí)間為12_30h，得到菌體種子液備用。優(yōu)選的，種子培養(yǎng)基木糖含量為5_25gL,蛋白胨含量為3_8gL,酵母膏含量為
2-6gL, K2HPO4 含量為 l-3g/L, MgSO4 · 7H20 含量為 O. 1-0. 3g/L, CaCl2 含量為 O. 1-0. 3g/L,pH4. 5-5. 5。優(yōu)選的，種子培養(yǎng)基裝液量為15-35%。優(yōu)選的，培養(yǎng)溫度為32_38°C。優(yōu)選的，搖床轉(zhuǎn)速為160_200rpm。(2)木糖醇的全細(xì)胞法發(fā)酵生產(chǎn)在無菌條件下將上述步驟(I)制備好的菌體種子液，按1-15%的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，裝液量為20-80%。所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖5-40g/L、蛋白胨5-40g/L、酵母膏5_30gL、玉米芯粉10_50g/L，pH4. 5-6. 5?？刂瓢l(fā)酵溫度為30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速為150-300rpm，發(fā)酵時(shí)間為24_120h。優(yōu)選的，發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖含量為10_25g/L,蛋白胨含量為l_25g/L,酵母膏含量為 5-15g/L，玉米芯粉含量為 10-30g/L，pH4. 5-5. 5。優(yōu)選的，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為30-60%。優(yōu)選的，接種量為3-10%。優(yōu)選的，培養(yǎng)溫度為32_38°C。優(yōu)選的，搖床轉(zhuǎn)速為160_200rpm。優(yōu)選的，發(fā)酵時(shí)間為60_100h。本發(fā)明采用代謝工程的思想，通過基因工程手段獲得重組的熱帶假絲酵母工程菌
株-C. tropicalis PNL,其出發(fā)菌株C. tropicalis CICC1779能高效地轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)木
糖醇。重組菌在保持原有木糖醇轉(zhuǎn)化特性的基礎(chǔ)上，通過導(dǎo)入外源木聚糖酶和木糖苷酶編碼基因，在原始菌株中重構(gòu)了木聚糖降解途徑，實(shí)現(xiàn)了木聚糖降解和木糖醇生產(chǎn)的耦合，獲得了以天然半纖維素原料為底物直接進(jìn)行木糖醇全細(xì)胞法發(fā)酵生產(chǎn)的特性。本發(fā)明中重組熱帶假絲酵母菌株的優(yōu)點(diǎn)在于木聚糖酶基因和木糖苷酶基因均置于酵母組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子PADHl的控制之下，不需要添加誘導(dǎo)劑，不必更換碳源，發(fā)酵工藝簡單，條件溫和；重組酶能表達(dá)分泌至發(fā)酵液中，活性高，木糖醇轉(zhuǎn)化率較高；重組菌株能以玉米芯等天然半纖維素原料為底物，全細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇，整個(gè)工藝過程成本低、能耗少、排污少，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明所保護(hù)的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :重組熱帶假絲酵母工程菌株的構(gòu)建(I)從土曲霉中克隆出木聚糖酶基因(atn)片段，與Genbank上已經(jīng)公布的木聚糖酶基因序列作BLAST比對，進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，克隆的atn基因?yàn)橐恍禄?Genbank注冊序列號為JQ087496)。(2)從土曲霉中克隆出木糖苷酶基因(atl)片段,與Genbank上已經(jīng)公布的木糖苷酶基因序列作BLAST比對分析，結(jié)果表明，克隆的atl基因序列與Genebank中已報(bào)道的A. terreus NIH2624中β -木糖昔酶序列完全一致。(3)利用基因工程手段將木聚糖酶基因(atn)和木糖苷酶基因(atl)串聯(lián)在一起，導(dǎo)入pAUR123載體中，構(gòu)建pAUR-atn-atl質(zhì)粒,將該質(zhì)粒導(dǎo)入熱帶假絲酵母中，構(gòu)建新的菌株，使木聚糖酶和木糖苷酶共表達(dá)，具體過程如下將atn基因連接到酵母真核表達(dá)載體pAUR123的多克隆位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒pAUR-atn ；根據(jù)PADHl和TADHl兩端的堿基序列設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端添加Dra III酶切位點(diǎn)，以pAUR-atn質(zhì)粒為模板，通過PCR方法擴(kuò)增atn基因的表達(dá)盒PADHl-atn_TADHl ；將atl基因連接到酵母真核表達(dá)載體pAUR123的多克隆位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒pAUR-atl ；將PADHl-atn-TADHl基因表達(dá)盒片段和pAUR-atl質(zhì)粒分別用Dra III進(jìn)行酶切，用T4DNA連接酶將二者連接，從而構(gòu)建其共表達(dá)載體pAUR-atn-atl。(4)重組熱帶假絲酵母工程菌株的構(gòu)建與鑒定將上述構(gòu)建成功的表達(dá)載體pAUR-atn-atl通過電擊法轉(zhuǎn)化到熱帶假絲酵母
C.tropicalisCICC1779中，通過金擔(dān)子素(AureobasidinA,AbA)抗性篩選及菌落PCR篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。(5)木聚糖培養(yǎng)基平板篩選鑒定挑取菌落PCR陽性的C. tropicalis PNL-At轉(zhuǎn)化子，接種到以木聚糖為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基平板上，同時(shí)接種一沒有轉(zhuǎn)化的熱帶假絲酵母原始菌作為對照。如果對照菌不能生長，而轉(zhuǎn)化的工程菌株能夠生長，說明重組菌能較好地利用木聚糖。篩選平板經(jīng)剛果紅染色后，重組菌周圍能夠產(chǎn)生透明圈，可以根據(jù)透明圈的大小，確定其代謝木聚糖的能力。挑選能夠產(chǎn)生較大透明圈的重組菌作為種子菌株，進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2 木聚糖酶基因(atn)和木糖苷酶基因(atl)在熱帶假絲酵母中的表達(dá)鑒定及活性分析挑選實(shí)施例I篩選出的重組菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，以離心后的培養(yǎng)物上清液為粗酶液，測定重組表達(dá)的木聚糖酶和木糖苷酶活力，挑選重組酶活力最高的菌株。實(shí)施例3 如實(shí)施例I所述重組熱帶假絲酵母菌株C. tropicalis PNL-At在木糖醇生產(chǎn)中的應(yīng)用
種子液培養(yǎng)從平板上挑取C. tropicalis PNL-At單菌落，接種于裝有5OmL種子培養(yǎng)基(木糖 20g/L、蛋白胨 5g/L、酵母膏 3g/L、Κ2ΗΡ042· 5g/L、MgSO4 · 7Η200· 25g/L、CaCl2O. 25gL, ρΗ5· 0)的 250mL 搖瓶中，35°C、170rpm 震蕩培養(yǎng) 24h。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)按5%的接種量轉(zhuǎn)接種子液至盛有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖20gL、蛋白胨20gL、酵母膏10gL、玉米芯粉15g/L，pH5. O)的250mL搖瓶中?？刂瓢l(fā)酵溫度為35°C,搖床轉(zhuǎn)速為170rpm,發(fā)酵時(shí)間為96h。每12h取樣一次,測定發(fā)酵液中木糖醇的含量，結(jié)果顯示，重組熱帶假絲酵母工程菌株C. tropicalis PNL-At能夠有效利用玉米芯半纖維素中的木聚糖產(chǎn)生木糖醇，在發(fā)酵第84h時(shí)發(fā)酵液中木糖醇含量達(dá)到最大值3. 17g/L，由于所用玉米芯中木聚糖含量為30%，則計(jì)算知木糖轉(zhuǎn)化木糖醇的轉(zhuǎn)化率為70. 4%。實(shí)施例4 如實(shí)施例3所述的重組熱帶假絲酵母菌株C. tropicalis PNL-At在木糖醇生產(chǎn)中的應(yīng)用，不同之處在于
步驟(2)中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10gL、蛋白胨15g/L、酵母膏7gL、玉米芯粉10g/L，pH5. 5 ;步驟(2)中裝液量為30% ;步驟(2)中發(fā)酵條件控制為發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm。經(jīng)HPLC分析，在發(fā)酵第72h時(shí)發(fā)酵液中木糖醇含量達(dá)到最大值I. 99g/L，由于所用玉米芯中木聚糖含量為30%，則計(jì)算知木糖轉(zhuǎn)化木糖醇的轉(zhuǎn)化率為66. 3%。
權(quán)利要求
1.一種重組熱帶假絲酵母工程菌株C. tropicalis PNL,其特征在于，將木聚糖酶和木糖苷酶基因表達(dá)盒串聯(lián)在一起，導(dǎo)入酵母表達(dá)載體PAUR123中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAUR123-xyn-xyl,將該質(zhì)粒導(dǎo)入木糖利用型熱帶假絲酵母中。
2.如權(quán)利要求I所述的重組熱帶假絲酵母工程菌株C.tropicalis PNL,其特征在于，在木糖利用型熱帶假絲酵母中構(gòu)建木聚糖降解途徑，所述重組菌株能共表達(dá)木聚糖酶和木糖苷酶。
3.如權(quán)利要求I所述的重組熱帶假絲酵母工程菌株C.tropicalis PNL,其特征在于，實(shí)現(xiàn)了木聚糖降解和木糖醇生產(chǎn)的耦合，能以天然半纖維素原料為底物進(jìn)行全細(xì)胞法直接生產(chǎn)木糖醇。
4.一種如權(quán)利要求I或2或3所述的熱帶假絲酵母工程菌株在利用玉米芯全細(xì)胞法發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于,所述熱帶假絲酵母工程菌株C.tropicalisPNL可通過如下步驟應(yīng)用于木糖醇生產(chǎn) (1)菌體種子液的制備在搖瓶中按10-50%的裝液量加入種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基配方為木糖(5-50g/L)、蛋白胨(l-10g/L)、酵母膏(l-10g/L)、K2HPO4 (l_5gL)、MgSO4 · 7H20 (O. 1-0. 5g/L)、CaCl2 (0. 1-0. 5gL)，pH4. 5-6. 5，在 100-130 °C 下滅菌 10_30min后，在無菌條件下從活化平板上挑取單菌落接入上述搖瓶中，培養(yǎng)溫度為30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速為150-300rpm，培養(yǎng)時(shí)間為12_30h，得到菌體種子液備用。
(2)木糖醇的全細(xì)胞法發(fā)酵生產(chǎn)在無菌條件下將上述步驟I制備好的菌體種子液，按1-15%的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，裝液量為20-80%。所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖5-40gL、蛋白胨5-40g/L、酵母膏5_30g/L、玉米芯粉10_50gL，pH4. 5-6. 5?？刂瓢l(fā)酵溫度為30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速為150-300rpm，發(fā)酵時(shí)間為24_120h。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(I)中所述的種子培養(yǎng)基木糖含量為5-25gL，蛋白胨含量為3-8gL，酵母膏含量為I_5gL，K2HPO4含量為l_3g/L，MgSO4 ·7Η20含量為 O. 1-0. 3g/L, CaCl2 含量為 O. 1-0. 3g/L, ρΗ4· 5-5. 5。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(I)中所述的培養(yǎng)條件為種子培養(yǎng)基裝液量為15-35%，培養(yǎng)溫度為32-38°C，搖床轉(zhuǎn)速為160_200rpm。
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖含量為10-25gL，蛋白胨含量為l_25gL，酵母膏含量為5-15g/L，玉米芯粉含量為10_30gL，pH4. 5-5. 5。
9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述的培養(yǎng)條件為接種量為3-10%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為30-60%，培養(yǎng)溫度為32-38°C，搖床轉(zhuǎn)速為160_200rpm，發(fā)酵時(shí)間為 60-1OOh。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用重組熱帶假絲酵母全細(xì)胞法生產(chǎn)木糖醇的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的用于木糖醇生產(chǎn)的基因工程菌是一種重組了外源木聚糖酶和木糖苷酶編碼基因的熱帶假絲酵母菌，可用于全細(xì)胞法生產(chǎn)木糖醇。本發(fā)明所保護(hù)的重組熱帶假絲酵母菌株在保持原有木糖醇轉(zhuǎn)化特性的基礎(chǔ)上，通過導(dǎo)入外源木聚糖酶和木糖苷酶編碼基因，在原始菌株中重構(gòu)了木聚糖降解途徑，實(shí)現(xiàn)了木聚糖降解和木糖醇生產(chǎn)的耦合，獲得了以天然半纖維素原料為底物直接進(jìn)行木糖醇全細(xì)胞法發(fā)酵生產(chǎn)的特性。本發(fā)明提供的利用重組熱帶假絲酵母全細(xì)胞法生產(chǎn)木糖醇的工藝簡單、成本低、條件溫和、能耗少、排污少，為木糖醇的生產(chǎn)開創(chuàng)了一條高效清潔無污染的工業(yè)化應(yīng)用技術(shù)。
文檔編號C12P19/02GK102943050SQ20121045236
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者李春, 郭曉曉, 戴大章 申請人:北京理工大學(xué)