專利名稱：一種羧酸酯酶及其在農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因降解中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種羧酸酯酶D_lCarE3及其在農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因降解中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
羧酸酯酶(Carboxylesterases, E C3. I. I. I)是一類能夠催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特異性酯酶，與脂肪酶同屬于a/0水解酶家族成員，其氨基酸序列含有Ser-Asp -His三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，Ser, Asp, His構(gòu)成了羧酸脂酶的催化活性中心(Nardini, M, etal., Current Opinion in Structural Biology. 1999, 9 (6):732-737.)。
羧酸脂酶廣泛存在于動物、植物、微生物中(Melloney J.，et al.，journal ofMolecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32:261-270.),其中微生物來源的羧酸酯酶是一種重要的工業(yè)酶類，在催化酯水解、酯合成、酯交換等上有重要應(yīng)用價值，具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性(Ramos Tombo, et al. , Agricultural and BiologicalChemistry. 1987，51:1833-1838.)。這些獨特性質(zhì)使羧酸酯酶在食品、化工、制藥、能源開發(fā)和環(huán)境保護等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景(Jaeger K. E.，et al.，Trends inBiotechnology. 1998, 16 (9):396-403.)。當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，70%使用的農(nóng)藥是有機磷農(nóng)藥，而70%的有機磷農(nóng)藥又是高毒農(nóng)藥，這些農(nóng)藥的使用很容易在農(nóng)產(chǎn)品中殘留，進而影響到人的健康。本文研究的羧酸酯酶是一種重要的農(nóng)藥降解酶，其對含有羧酸酯鍵的有機磷化合物，如馬拉硫磷，羧酸酯酶靠活性中心絲氨酸的可逆?；饔脕硗瓿山到狻＿@個?；饔冕尫懦鲆粋€醇部分和一個對應(yīng)的共價?；浮＿@個?；闹虚g體由于水的親核作用釋放出對應(yīng)的羧酸部分和有活性的酶，它可以重新來催化新一輪的降解反應(yīng)。利用微生物降解農(nóng)藥殘留大多數(shù)是依靠胞內(nèi)酶的酶解作用，但由于野生菌株產(chǎn)酶能力有限、發(fā)酵周期長、純化復(fù)雜、難以大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本高，限制了其推廣應(yīng)用。利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建高效生物反應(yīng)器，可以提高羧酸酯酶的表達量，實現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本文從嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌D-I基因組中克隆羧酸脂酶基因D-lCarE3與表達載體pET28a(+)連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達并對羧酸酯酶酶學(xué)性質(zhì)及羧酸酯酶對農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因的降解活性進行了初步研究，為進一步探索羧酸酯酶的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羧酸酯酶D_lCarE3。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述羧酸酯酶的基因本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的最后一個目的是提供上述羧酸酯酶D_lCarE3在馬拉硫磷和西維因的降解中的應(yīng)用。本發(fā)明所述羧酸酯酶D-lCarE3可得自嗜熱脂環(huán)芽孢桿菌(thermophilicAU eye lobaci Ilus tengchongensisstrain CGMCC1504XD-lCarE3 的氨基酸序列如 SEQ IDNO. I所示。本發(fā)明的羧酸酯酶D_lCarE3總共含有513個氨基酸，理論分子量為56. 01 kDa，理論等電點為5. 69。以P -乙酸萘酯為底物該酶作用的最適溫度65 V ;最適pH7. 0 ;終濃度I mM的金屬離子K+和Pb2+對酶有激活作用，Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ag+、Hg2+和Mn2+等有抑制作用；在溫度37 °C保溫50 min，仍能保持70%以上的活性；經(jīng)1/15 mol/L pH7. 0緩沖液下處理50 min，仍能保持50%以上的活性；酶液在室溫(23 °C )放置5 d，仍有27%以上的活 性。本發(fā)明提供了編碼上述羧酸酯酶的基因D_lCarE3,該基因序列如SEQ ID NO. 2。本發(fā)明通過PCR的方法克隆了羧酸酯酶D_lCarE3的編碼基因其全長1542 bp,起始密碼為 ATG,終止密碼為 TGA。經(jīng) BLAST 在 GeneBank(http://www. ncbi. nlm.nih. gov)數(shù)據(jù)庫進行比對分析,該羧酸酯酶基因編碼的氨基酸序列與GeneBank今 Alicyclobacillus acidocaldarius subsp 來源的潛在羧酸脂酶(ZP_10955244. I)具有最高一致性，為 98% (2012-11-8)。本發(fā)明還提供了包含上述羧酸酯酶基因的重組載體，優(yōu)選為m-D-lCarE3。將本發(fā)明的羧酸酯酶基因插入到表達載體合適的限制性內(nèi)切酶位點之間，使其核苷酸序列與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，將本發(fā)明的羧酸酯酶基因插入到質(zhì)粒pET-28a(+)上的及I和通o I限制性酶切位點之間，得到重組大腸桿菌表達質(zhì)粒m-D_lCarE3。本發(fā)明還提供了包含上述羧酸酯酶基因的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株(DE3)/ D-lCarE3。本發(fā)明制備羧酸酯酶D_lCarE3的方法按以下步驟進行
1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組羧酸酯酶表達；
3)回收并純化所表達的羧酸酯酶D-lCarE3。其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株現(xiàn)之2 (DE3)/ D_lCarE3。本發(fā)明提供了一個羧酸酯酶基因，其編碼的羧酸酯酶以￠-乙酸萘酯為底物最適溫度65 0C ;最適pH7. 0 ;終濃度I mM的金屬離子K+和Pb2+對酶有激活作用，Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ag+、Hg2+和Mn2+等有抑制作用；在溫度37 °C保溫50 min，仍能保持70%以上的活性；經(jīng)1/15 mol/L pH7. 0緩沖液下處理50 min，仍能保持50%以上的活性；酶液在室溫(23 V )放置5 d，仍有27%以上的活性；同時也能夠水解a -乙酸萘酯。本發(fā)明的羧酸酯酶D_lCarE3在降解農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因上的應(yīng)用。I)取I mL稀釋100倍的純化重組羧酸酯酶D-lCarE3加入到含有濃度為5 mg/L農(nóng)藥馬拉硫磷的1/15 mol/L、pH7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，總反應(yīng)體系為3 mL，37 1震蕩反應(yīng)，對農(nóng)藥馬拉硫磷進行降解。2)取I mL稀釋10倍的純化重組羧酸酯酶D_lCarE3加入到含有濃度為100 m g/L農(nóng)藥西維因的1/15 mol/L、pH7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，總反應(yīng)體系為3mL，37 1震蕩反應(yīng)，對農(nóng)藥西維因進行降解。取抽提液于氣相色譜上定量分析，100 min內(nèi)分別有68%的馬拉硫磷和57%的西維因被降解。本發(fā)明羧酸酯酶基因來源于嗜熱脂環(huán)芽孢桿菌(thermophilicAli eye lobaci Ilus tengchongensisstrain CGMCC1504),通過構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，與已報道降解農(nóng)藥馬拉硫磷的原始菌株人7幻'/ 從<3<^77^5 sp. (Baljinder Singh, Jagdeep Kaur,Kashmir Singh. Biotechnol Lett, 2012, 34: 863-867)相比，具有培養(yǎng)周期短、易于獲得純蛋白以及高效降解馬拉硫磷的優(yōu)點，比已報道昆蟲來源的羧酸酯酶(Wensheng Lan,Jian Chong, Hong Jiang, et al. Biotechnol Lett, 2005, 27: 1141-1146)對農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因的降解效率提高。在農(nóng)藥污染治理方面具有重要意義。此外，關(guān)于微生物來源的羧酸酯酶工程菌的構(gòu)建及對農(nóng)藥降解的研究少見報道，本發(fā)明對開發(fā)微生物來源的羧 酸酯酶對農(nóng)藥降解的應(yīng)用具有重要意義。


圖I :在大腸桿菌中表達的重組羧酸酯酶D_lCarE3的SDS-PAGE分析，其中，M :低分子量蛋白質(zhì)Marker ；1 :純化的重組羧酸酯酶D_lCarE3。圖2 :重組羧酸酯酶D_lCarE3的最適溫度。圖3 :重組羧酸酯酶D_lCarE3的熱穩(wěn)定性。圖4 :重組羧酸酯酶D_lCarE3的室溫下的穩(wěn)定性。圖5 :重組羧酸酯酶D_lCarE3的最適pH。圖6 :重組羧酸酯酶D_lCarE3的pH穩(wěn)定性。圖7 :不同金屬離子及化學(xué)試劑對重組羧酸酯酶D_lCarE3活性的影響。圖8 :重組羧酸酯酶D_lCarE3 1/[S]與1/V的關(guān)系。圖9 :農(nóng)藥馬拉硫磷的標(biāo)準曲線。圖10 :重組羧酸酯酶D_lCarE3對馬拉硫磷的降解曲線。圖11 :農(nóng)藥西維因的標(biāo)準曲線。圖12 :重組羧酸酯酶D_lCarE3對西維因的降解曲線。
具體實施例方式實驗材料和試劑
I、菌株及載體嗜熱脂環(huán)芽孢桿菌(thermophilic AU eye lobaci Ilustengchongensisstrain CGMCC1504)為保藏菌株；大腸桿coli BL21 (DE3)和表達載體pET_28a ( + )可購于Novagen公司。2、酶類及其它生化試劑限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；T4連接酶購自Promega公司；堅固藍B、色譜純正己燒、馬拉硫磷和西維因購自Sigma公司；其它試劑均購自國藥集團。3、培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，氯化鈉1%，pH自然(約為7. O)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。 實施例I :羧酸酯酶基因D_lCarE3的克隆
提取嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌D-I基因組DNA=CTAB裂解法，具體步驟為將液體培養(yǎng)12 h的新鮮菌液離心取菌體，加入800 111溶液1( 20 mM Tris，pH8. 0, 2 mM Na2-EDTA,終濃度20 mg/mL溶菌酶)，37 °C保溫30 min，加100 u L 10% SDS上下顛倒混勻，再加10 u L10 mg/mL 的蛋白酶 K，37 °C保溫 30 min，加 150 u L 5 M NaCl 和 150 u L 10% CTAB 溶液上下顛倒混勻，65 °C保溫20 min，分裝成600 U L每管，再加入600 U L酚/氯仿/異丙醇(體積比25 :24 :1)進行抽提，在4 °C下12000 rpm離心10 min，取上清300 y L于300 u L氯仿/異丙醇(體積比24 :1)中再次抽提除去雜蛋白，4 1下12000 rpm離心10 min，再取上清并加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的pH5. 2 3M NaAc，-70°C沉淀lh，4 1下13500rpm離心20 min,棄上清,再用70%的乙醇洗漆兩次,真空干燥,加入適量TE溶解,置于-20°C備用。根據(jù)嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌D-I全基因組測序及基因注釋分析羧酸酯酶基因D~lCarE3并設(shè)計表達引物CarF和CarR
上游引物 CarF: 5 ’ CGCGGATCCATGAACGTTAACTTGAACCGCGTG 3，(劃線部分為 BamA I 酶切位點)
下游引物 CarR: 5’ CCGCTCGAGGCCCCGAAGGCCCGGCCACT 3’(劃線部分為 ZAo I 酶切位
點)
上游引物 17: 5 ’ TAATACGACTCACTATAGGG 3，
下游引物Hter: 5’TGCTAGTTAITGCTCAGCGG 3’為PCR檢測陽性克隆子引物。以嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌D-I基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C 預(yù)變性 5 min;然后 94 °C 變性 30 sec ；48 °C 退火 30 sec ；72 °C 延伸 I min30 sec ;30 個循環(huán)后72 °C保溫5 min。PCR純化產(chǎn)物經(jīng)I和沿o I雙酶切，回收目的片段，再與經(jīng)過同樣酶切處理過的表達載體pET-28a(+)連接構(gòu)建質(zhì)?！鉉過夜。取10U I 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 100 u I Escherichia coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于含Kan的LB固體平板上，37 1溫箱培養(yǎng)13 h，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，使用引物(T7，ITter)進行菌落PCR擴增篩選陽性克隆子，從而獲得重組大腸桿菌菌株(DE3)/D-1 CarE3 o實施例2 :重組羧酸酯酶D_lCarE3的制備
取含有重組質(zhì)粒v^_D-lCarE3的Escherichia coli BL21 (DE3)菌株和只含有pET-28a (+)的空質(zhì)粒coli BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接種量接種于LB (含50 l^g/mL Kan)培養(yǎng)液中，37 1快速振蕩16 h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB (含50吒/mL Kan)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2-3 h (OD600達到0.6-1. 0)后，加入終濃度0. 7 mM的IPTG進行誘導(dǎo)，于20 1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20 h或26 °C振蕩培養(yǎng)約8 h。12000 rpm離心5 min，收集菌體。用適量的pH7. 0 Tris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的粗酶液經(jīng)13，000 rpm離心10 min后,吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果(圖I)表明，重組羧酸酯酶在大腸桿菌中得到了表達，經(jīng)Nickel-NTA Agarose純化后為單一條帶。純化的重組羧酸酯酶D_lCarE3的性質(zhì)測定
I、重組羧酸酯酶D-lCarE3的活性分析
實施例2純化的重組羧酸酯酶D-lCarE3的活性測定方法采用P -萘酚法取三支10ml試管,分別編號1、2、3，I號和2號試管為實驗組,3號為對照組。分別向I號和2號試管中加入2. 5 ml l/15mol/L pH為7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，向3號試管中加A3 ml l/15mol/L pH為7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。向三支試管中加入30Ul底物P -乙酸萘酯醇溶液，置于37 °C水浴鍋中預(yù)熱5 min，然后向I號和2號試管中加入0.5 ml適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng)5 min后，將三支試管取出，在冰浴條件下每支試管加入 0.5 ml顯色劑(1%堅固藍B鹽水溶液和5% SDS使用前2 :5混合)溶液，充分搖勻后，靜置5 -10 min后,在分光光度計550 nm下測定其吸光度值。I個酶活單位(U/mL)定義為一定條件下，每分鐘分解底物￠-乙酸萘酯生成I UmoL ￠-萘酚所需要的酶量。以a-乙酸萘酯為底物測定方法及酶活力計算同￠-乙酸萘酯，吸光度值在595 nm下讀取。2、重組羧酸酯酶D_lCarE3的最適溫度和熱穩(wěn)定性的測定
酶的最適溫度的測定將羧酸酯酶D-lCarE3在1/15 mol/L pH7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液條件下，分別在 6 0C >15 0C >22 0C >30 °C >37 °C >45 °C >55 °C >60 °C >650C >70 0C >75 0C >80 0C >85 °C下進行酶促反應(yīng)。溫度穩(wěn)定性的測定將羧酸酯酶D_lCarE3在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液條件下，在37 °C、65 1和75 V三個溫度下分別保溫10 min、20 min、30 min、40 min和50 min后進行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。室溫穩(wěn)定性的測定將羧酸酯酶D-lCarE3室溫(23 °C )放置5 d，在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液和最適反應(yīng)溫度下每天測定殘余酶活。以￠-乙酸萘酯為底物，反應(yīng)5 min，測定純化羧酸酯酶D-lCarE3的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明D-lCarE3的最適溫度65 V (圖2);37 °C保溫50 min，仍能保持70%以上的活性(圖
3);酶液在室溫(23 °C)放置5 d，仍有27%以上的活性(圖4)。3、重組羧酸酯酶D_lCarE3的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定
酶的最適pH的測定將羧酸酯酶D-lCarE3在最適溫度65 °C,分別在1/15 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液不同PH4. 8,5. 4,6. 0,6. 5,7. 0,7. 3,7. 5和8. 0條件下酶促反應(yīng)。pH穩(wěn)定性的測定將羧酸酯酶D-lCarE3在最適溫度65°C，在pH5. 4、pH7. 0和pH8. 0下分別耐受10 min、20 min、30 min、40 min和50 min后進行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。以P -乙酸萘酯為底物，反應(yīng)5 min,測定純化羧酸酯酶D-lCarE3的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明D-lCarE3的最適pH7. 0 (圖5);經(jīng)1/15 mol/L pH7. 0緩沖液下處理50 min，仍能保持50%以上的活性(圖6)。4、不同金屬離子及化學(xué)試劑對重組羧酸酯酶D_lCarE3活性的影響
在酶促反應(yīng)體系中加入終濃度I mM的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性的影響。以3 -乙酸萘酯為底物，在65 0C、pH7. 0條件下，反應(yīng)5 min,測定純化羧酸酯酶D_lCarE3的酶活力。結(jié)果(圖7)表明，終濃度I mM的金屬離子K+和Pb2+對酶有激活作用，Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ag+、Hg2+和Mn2+等有較強的抑制作用。5、重組羧酸酯酶D_lCarE3的動力學(xué)參數(shù)的測定在65 °C、pH7.0條件下，以0.6 M P -乙酸萘酯為底物，依次在酶促反應(yīng)的1_30min內(nèi)終止反應(yīng)并測定酶活性，計算出酶活性與反應(yīng)時間的比值，若在一定時間內(nèi)該比值保持穩(wěn)定，則此時間為一級反應(yīng)時間。用0.1-0. 95 mM ￠-乙酸萘酯為底物([S])，在65 °C、pH7.0和一級反應(yīng)時間下測定酶活，計算出相應(yīng)的反應(yīng)速度(V)，如圖8，根據(jù)Lineweaver-Burk方法測定心 和fear。經(jīng)測定，在65 °C、pH7. 0條件下，重組羧酸酯酶D-lCarE3對旦-乙酸萘酯的命和Vmax分別為0. 7524mM和3. 1817 U/mg。6、重組羧酸酯酶D_lCarE3對底物a -乙酸萘酯的水解
在40 °C、pH6. 5條件下，重組羧酸酯酶D-lCarE3對0.6 mol/L a-乙酸萘酯的比活力為 68.415 U/mg。實施例3: 純化的重組羧酸酯酶D-lCarE3在農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因的降解中的應(yīng)用
I、重組羧酸酯酶D-lCarE3對農(nóng)藥馬拉硫磷的降解作用
取I mL稀釋100倍的純化重組羧酸酯酶D-lCarE3加入到含有濃度為5 mg/L農(nóng)藥馬拉硫磷的1/15 mol/L、pH7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，總反應(yīng)體系為3 mL,37 °C震蕩反應(yīng)；對照組不加酶液，以I mL、pH7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液代替酶液，每20 min取出0.5 mL反應(yīng)液與等體積正己燒混合震蕩，12000 rpm離心2 min,取上層抽提液加入0.2 g無水硫酸鈉除水，12000 rpm離心30 sec,取抽提液于氣相色譜上定量分析。色譜分析所用儀器為Agilent GC7890-MS5975型氣相色譜(美國)，檢測器為FID，柱子為Agilent DB-17 (30 mXO. 32 mmXO. 25 U m)，操作條件進樣量I yl，不分流，進樣口溫度250 °C，He壓力16.363 psi，柱流量I mL/min，離子源230 °C，MS四級桿150 °C ；柱箱程序升溫205 V (保持2. 5 min)，以10 °C/min的速度上升至220 °C，保持2 min,總時間6 min。分別配制不同濃度梯度的農(nóng)藥馬拉硫磷標(biāo)準品，根據(jù)以上色譜分析方法分析，積分計算不同濃度下的峰面積，每個濃度重復(fù)3次，計算峰面積平均值，以農(nóng)藥馬拉硫磷濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)做馬拉硫磷標(biāo)準曲線(圖9)。并測定和計算其檢測限為
0.I mg/L，方法回收率為84%-92%。羧酸酯酶D_lCarE3對農(nóng)藥馬拉硫磷的降解結(jié)果(圖10)表明,在上述條件下，100min內(nèi)有68%的馬拉硫磷被降解。2、重組羧酸酯酶D_lCarE3對農(nóng)藥西維因的降解作用
取I mL稀釋10倍的純化重組羧酸酯酶D-lCarE3加入到含有濃度為100 m g/L農(nóng)藥西維因的1/15 mol/L、pH7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，總反應(yīng)體系為3 mL,37 1震蕩反應(yīng)，對照組不加酶液，以I mL、pH7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液代替酶液，每20 min取出0.5 mL反應(yīng)液與等體積二氯甲燒混合震蕩，12000 rpm離心2 min,取上層抽提液加入0.2 g無水硫酸鈉除水，12000 rpm離心30 sec,取抽提液于氣相色譜上定量分析。色譜分析所用儀器為Agilent GC7890-MS5975型氣相色譜(美國)，檢測器為FID，柱子為 Agilent DB-17 (30mX0. 32_X0. 25 y m)，操作條件進樣量 I yl，分流比 20:1，進樣口溫度270 °C，柱流量I mL/min，He壓力14.993 psi，離子源230 °C，MS四級桿150°C;柱箱程序升溫180 °C (保持I min)，以10 V /min的速度上升至220 °C，保持3 min,總時間8 min。分別配制不同濃度梯度的農(nóng)藥西維因標(biāo)準品，根據(jù)以上色譜分析方法分析，積分計算不同濃度下的峰面積，每個濃度重復(fù)3次，計算峰面積平均值，以農(nóng)藥西維因濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)做西維因標(biāo)準曲線(圖11)。并測定和計算其檢測限為0.01 mg/L，方法回收率為87%-92. 5%。羧酸酯酶D_lCarE3對農(nóng)藥西維因的降解結(jié)果(圖12)表明，在上述條件下，100min內(nèi)有57%的西維因被降解。
權(quán)利要求
1.一種羧酸酯酶D-lCarE3，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種編碼權(quán)利要求I所述的羧酸酯酶D-lCarE3的羧酸酯酶基因其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種包含權(quán)利要求2所述羧酸酯酶基因D-lCarE3的重組載體。
4.一種包含權(quán)利要求2所述羧酸酯酶基因D-lCarE3的重組菌株。
5.一種羧酸酯酶D-lCarE3在農(nóng)藥馬拉硫磷降解中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的羧酸酯酶D-lCarE3在農(nóng)藥馬拉硫磷降解中的應(yīng)用，其特征在于按以下方法進行取I mL稀釋100倍的純化重組羧酸酯酶D-lCarE3加入到含有濃度為5 mg/L農(nóng)藥馬拉硫磷的1/15 mo I/L、pH7. O的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，總反應(yīng)體系為3 mL，37 1震蕩反應(yīng)，對農(nóng)藥馬拉硫磷進行降解。
7.一種羧酸酯酶D-lCarE3在農(nóng)藥西維因降解中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的羧酸酯酶D-lCarE3在農(nóng)藥西維因降解中的應(yīng)用，其特征在于按以下方法進行取I mL稀釋10倍的純化重組羧酸酯酶D-lCarE3加入到含有濃度為100m g/L農(nóng)藥西維因的1/15 mol/L、pH7. O的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，總反應(yīng)體系為3 mL，37 1震蕩反應(yīng)，對農(nóng)藥西維因進行降解。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種羧酸酯酶D-1CarE3、基因D-1CarE3及羧酸酯酶D-1CarE3在農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因的降解上的應(yīng)用。羧酸酯酶D-1CarE3，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，羧酸酯酶的編碼基因D-1CarE3核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，以及羧酸酯酶基因D-1CarE3的重組載體和羧酸酯酶基因D-1CarE3的重組菌株。本發(fā)明還提供了羧酸酯酶D-1CarE3在農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因的降解中的應(yīng)用。本發(fā)明具有培養(yǎng)周期短、易于獲得純蛋白以及高效降解馬拉硫磷的優(yōu)點，比已報道昆蟲來源的羧酸酯酶對農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因的降解效率提高。在農(nóng)藥污染治理方面具有重要意義。
文檔編號C12N9/18GK102965355SQ20121046122
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者黃遵錫, 謝振榮, 丁俊美, 周峻沛, 李俊俊, 唐湘華, 楊云娟, 許波 申請人:云南師范大學(xué)