專利名稱：一種檢測(cè)鉻生物可利用度的微生物細(xì)胞傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水體及土壤中鉻生物可利用度的微生物細(xì)胞傳感器的搭建及使用。
背景技術(shù)：
鉻(Cr)是人體必需的微量元素，在冶金、電鍍、制革和化學(xué)品制造等行業(yè)被廣泛應(yīng)用。Cr3+是對(duì)人體有益的元素，而Cr6+是有毒的。鉻污染主要是由于在鉻礦、鉻制品的生產(chǎn)過程中對(duì)鉻廢水和鉻渣的不合理處理造成的。在土壤中，鉻以Cr3+和Cr6+這兩種形態(tài)存在，Cr6+以陰離子的形態(tài)存在，不易被土壤吸附，有較強(qiáng)的移動(dòng)性，易對(duì)植物產(chǎn)生毒性，進(jìn)而通過農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)入人體直接危害人體健康，而Cr3+極易被土壤膠體吸附以及形成沉淀，移動(dòng)性差，毒性較低。Cr6+對(duì)人主要是慢性毒害，它可以通過消化道、呼吸道、皮膚和粘膜侵入人體，在體內(nèi)主要積聚在肝、腎和內(nèi)分泌腺中。通過呼吸道進(jìn)入的則易積存在肺部，通過強(qiáng)氧化作用產(chǎn)生毒性。由于Cr6+毒性較強(qiáng)，直接決定著Cr的毒性大小，對(duì)污染環(huán)境中Cr6+進(jìn)行準(zhǔn)確、合理地檢測(cè)及評(píng)價(jià)是進(jìn)行Cr污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及修復(fù)的前提。目前監(jiān)測(cè)和檢測(cè)重金屬污染物主要有兩種方法一種是物理化學(xué)分析法，如電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等，其優(yōu)點(diǎn)是具備高檢測(cè)靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長，最重要的一點(diǎn)是，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要是對(duì)環(huán)境重金屬總量進(jìn)行測(cè)定，不能檢測(cè)重金屬的生物可利用度；另一種方法是基于生物有機(jī)體的生物傳感器，其優(yōu)勢(shì)是可以直接反映污染物對(duì)生物有機(jī)體的毒性及影響。微生物細(xì)胞具有易操作，繁殖及生存能力強(qiáng)，易儲(chǔ)存和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，以微生物細(xì)胞為生物學(xué)感應(yīng)元件的微生物細(xì)胞傳感器可以極大簡化傳感器的制作過程，提高傳感器的檢測(cè)效率。微生物細(xì)胞傳感器的微生物細(xì)胞含有一個(gè)由特異調(diào)控蛋白基因和報(bào)告基因組成的重組質(zhì)粒。當(dāng)宿主細(xì)胞的生長環(huán)境中有重金屬離子存在時(shí)，宿主細(xì)胞通過不同的機(jī)制吸收重金屬離子。當(dāng)重金屬離子進(jìn)入到胞內(nèi)后，重組質(zhì)?；蛩拗魅旧wDNA編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白被重金屬離子特異激活，與啟動(dòng)子綁定或從啟動(dòng)子上脫落，激活(“turn on”)或抑制(“turn off”)啟動(dòng)子的啟動(dòng)，進(jìn)而調(diào)控下游報(bào)告基因表達(dá)，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，這種信號(hào)的變化強(qiáng)度與重金屬誘導(dǎo)物的濃度密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白對(duì)重金屬離子的識(shí)別能力和綁定能力決定著微生物全細(xì)胞傳感器的檢測(cè)特異性和靈敏度。微生物細(xì)胞傳感器已成為重金屬生物可利用度監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)污染評(píng)價(jià)的重要工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有的化學(xué)檢測(cè)方法不能反映鉻的生物可利用度且存在操作復(fù)雜、儀器價(jià)格昂貴等問題，利用Cmetallidurans CH34菌株的pM0L28質(zhì)粒鉻抗性操縱子chr的啟動(dòng)子序列、調(diào)控蛋白基因chrB和商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc的熒光素酶報(bào)告基因(Iuc)，構(gòu)建了一種微生物細(xì)胞傳感器，從而提供了一種具有高靈敏度、低成本等特點(diǎn)的鉻生物可利用度檢測(cè)方法。構(gòu)建該細(xì)胞傳感器的具體操作步驟為1、T7啟動(dòng)子和報(bào)告基因的拼接以商業(yè)化質(zhì)粒載體pRSET A. B. C為模板，PCR擴(kuò)增得到T7啟動(dòng)子片段f I ；以商業(yè)化質(zhì)粒載體pGEM-luc為模板，PCR擴(kuò)增得到熒光素酶報(bào)告基因Iuc片段f2 ;將片段Π和f2按一定比例混合，以混合液為模板，PCR擴(kuò)增得到T7啟動(dòng)子和報(bào)告基因Iuc的拼接片段f3 ；
2、包含T7啟動(dòng)子的報(bào)告基因?qū)隤UC18質(zhì)粒對(duì)pUC18質(zhì)粒用SacI與BamHI進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到載體vl ;對(duì)拼接序列f3用SacI與BamHI進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到片段f4 ;將片段f4連入載體vl，利用大腸桿菌E. coli作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到含有T7啟動(dòng)子和報(bào)告基因Iuc的載體v2 ；3、載體v2中Iac啟動(dòng)子的去除以pUC18為模板，擴(kuò)增得到不含Iac啟動(dòng)子的pUC18部分序列f5 ;對(duì)f5用SacI和HindIII進(jìn)行雙酶切處理后純化得到片段fV ;對(duì)載體v2用SacI和HindIII進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到載體v3 ;將片段fV連入載體v3，利用大腸桿菌作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到含有T7啟動(dòng)子和報(bào)告基因Iuc且去除Iac啟動(dòng)子的載體v4 ；4、載體v4與T7終止子的拼接以pET30a為模板，擴(kuò)增得到T7終止子片段f6 ;對(duì)片段f6用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到片段f6';對(duì)載體v4用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到載體v5 ;將片段f6'連入載體v5，利用大腸桿菌E. coli作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的基礎(chǔ)型傳感器細(xì)胞；5、基礎(chǔ)型傳感器的表達(dá)能力驗(yàn)證用2mM的IPTG誘導(dǎo)基礎(chǔ)型傳感器細(xì)胞，采用Varioskan Flash全波長掃描多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其發(fā)射光譜以驗(yàn)證基礎(chǔ)型傳感器細(xì)胞對(duì)報(bào)告基因的表達(dá)能力。6、目標(biāo)質(zhì)粒的構(gòu)建以pM0L28質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到包含chr啟動(dòng)子和調(diào)控蛋白基因chrB的片度f7 ；對(duì)片段f7用SacI和XhoI進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到片段f7/ ;對(duì)基礎(chǔ)型傳感器細(xì)胞質(zhì)粒v6用SacI和XhoI進(jìn)行雙酶切處理，純化后得到片段v6';將片段fT連入載體ν6'，利用大腸桿菌E. coli作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到目標(biāo)質(zhì)粒v7 ；7、目標(biāo)傳感器細(xì)胞的搭建完成利用商業(yè)化宿主感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌E. coli DH5a為宿主，將目標(biāo)質(zhì)粒v7轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞得到可檢測(cè)鉻生物可利用度的微生物細(xì)胞傳感器。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例I :第一步接種傳感器細(xì)胞單菌落于50mL三角瓶中，添加氨芐青霉素到終濃度為100 μ g/mL, 37 °C，200r · mirT1 過夜培養(yǎng)；第二步取O. 5mL的上述菌液到14. 5mL的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C，200r ·ιιι η_1培養(yǎng)至 OD600 = 1.2 ；第三步將菌液用新鮮LB培養(yǎng)基稀釋至OD6tltl = 0.4 ；第四步取50 μ L稀釋后的菌液分別與鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測(cè)樣品等體積混合，30°C靜置誘導(dǎo)；第五步將40 μ L空載體細(xì)胞與50 μ L誘導(dǎo)培養(yǎng)液混合，加入10 μ LlMK2HPO4(ρΗ7. 8)和20mM EDTA的裂解緩沖液，_70°C條件下快速冷凍混合物lOmin，然后23°C水浴細(xì)胞3min，最后加入300 μ L新鮮配制的裂解混合物(見附錄)，混勻后室溫孵育IOmin ；第六步每個(gè)96孔板中加入20 μ L的裂解液，再加入100 μ L熒光素酶檢測(cè)液后，用熒光檢測(cè)儀立刻檢測(cè)；
第七步根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品誘導(dǎo)下傳感器細(xì)胞的熒光值，制作熒光強(qiáng)度和誘導(dǎo)物鉻濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的中鉻的相對(duì)濃度。附錄 IOmL裂解混合物配方5. 5mL 水2mL5 X CCLR25mg BSA2. 5mL 溶菌酶混合液(5mL 配方0. 5mLlM K2HPO4 (pH7. 8)與 20mM EDTA 的混合液，4. 5mL無菌水,25mg溶菌酶,混勻)Τ7啟動(dòng)子序列CGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAA熒光素酶報(bào)告基因Iuc序列ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAGGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGC CCGCGAACGA CATTTATAAT GAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAMGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAATACAAAGGATATCAGGTGGCCCCCGCTGAATTGGAATCGATATTGTTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAA GTCCAAATTGTAAT7終止子序列ATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCchr啟動(dòng)子序列·TAGGCTGTTCTGCAATGAACGCTTCTCCCATCCTCTCCCGAGGACTGCTGCTACTGCTCGTCGTTAGCTTGCAACATCGCTCACTGCGCGC調(diào)控基因chrB序列ATGCGAATCTGGCGCGGGATCAAGGCGCTTGGCGGCACAGCACTGCGGGACGGGGCTATCTACTCCCCAATCTGCCAGGACTGCGGGCACCTTTGCAGACACTGGCAACCCGATGCGGCCAGTGAGGATGGCAAGGTCTGGATGCTGTCCGTACAGGCCGCTGACGACCAGCAGGAGGCGGAGTATCGCGCGTTGTTCGACCGGTCCACCGAATATGCCGAATGGATGGTCGAACTCTCCAGCGCCCGCTCAACATTGTCCGATTCGGACGAGGCGGAGCTGCTGCGCGTGGCACGCCGGCACGGTCGAGGGATCGACGCTATCCGCAAGGTCGATTTTTTCCCTAACGAGGCGTCCGCCCGTGCCGAATTGCAGTGGCGCGACTTCAATGCAGCGATCGACATCTTGCTTTCGCCCGGCGAGCCGCACGGAGTAGCCGGCAACATTCCGCGACGTGACCCGACCCAGTATCAGGGGCGCCAGTGGGCGACCCGCCAGCATCTATGGGTAGACCGTGTCGCCTGCGCTTGGTTGATCCGGCGCTTTATCGATCCCCATGCCACTTTTCTCTGGCTCGAAGATGTCCGTCAGTGCCCTGACGACGCACTTGGATTCGACTTCGATGGCGCGACGTTCACACACATTGGCGACCGCGTTTCGTTTGAGGTGCTGCTCGCCAGCTTCGGACTAGACGAAGACAAAGGGCTCGCCCGCCTCGGCCAGATGATCCATGTTCTGGATGTCGGCGGCACACCGGTTGCCGAAGCCAGTGGCTTTGAGGCAGTGCTGGCAGGCGCCCGGGAACGCCTCCCTAACGACGACGCACTGCTGGATGAAGTCGGCTATGTCCTCGACTCGCTGTACACGCATTTCTCAAGCCCGCGCAAACGCT
權(quán)利要求
1.一種微生物細(xì)胞傳感器，由細(xì)菌作基本材料，通過基因工程手段構(gòu)建，用來檢測(cè)水體和土壤中鉻的生物可利用度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物細(xì)胞傳感器，其特征在于大腸桿菌為宿主細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物細(xì)胞傳感器，其特征在于高靈敏度的螢火蟲熒光素酶Iuc為報(bào)告基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物細(xì)胞傳感器，其使用方法 第一步接種傳感器細(xì)胞單菌落于50mL三角瓶中，添加氨芐青霉素到終濃度為100 μ g/mL, 37 °C，200r · mirT1 過夜培養(yǎng)； 第二步取O. 5mL的上述菌液到14. 5mL的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C，200r -min^1培養(yǎng)至OD6OO =1.2; 第三步將菌液用新鮮LB培養(yǎng)基稀釋至OD6tltl = 0.4 ； 第四步取50 μ L稀釋后的菌液分別與鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測(cè)樣品等體積混合，30°C靜置誘導(dǎo)； 第五步將40 μ L空載體細(xì)胞與50 μ L誘導(dǎo)培養(yǎng)液混合，加入10 μ LlM K2HPO4 (pH7. 8)和20mM EDTA的裂解緩沖液，_70°C條件下快速冷凍混合物lOmin，然后23°C水浴細(xì)胞3min，最后加入300 μ L新鮮配制的裂解混合物(見附錄)，混勻后室溫孵育IOmin ； 第六步每個(gè)96孔板中加入20 μ L的裂解液,再加入100 μ L熒光素酶檢測(cè)液后,用熒光檢測(cè)儀立刻檢測(cè)； 第七步根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品誘導(dǎo)下傳感器細(xì)胞的熒光值，制作熒光強(qiáng)度隨誘導(dǎo)物鉻濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的中鉻的相對(duì)濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物細(xì)胞傳感器的使用方法，其特征在于微生物細(xì)胞傳感器的培養(yǎng)溫度為37°C，微生物細(xì)胞傳感器的誘導(dǎo)溫度為30°C，熒光強(qiáng)度值運(yùn)用熒光檢測(cè)儀進(jìn)行采集和檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鉻生物可利用度檢測(cè)的微生物細(xì)胞傳感器，適用于水體和土壤中鉻的生物可利用度的檢測(cè)。所述細(xì)胞傳感器包括大腸桿菌E.coli，大腸桿菌E.coli作為宿主細(xì)胞承載重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒為含有鉻抗性系統(tǒng)chr啟動(dòng)子、鉻抗性系統(tǒng)調(diào)控基因chrB、熒光素酶基因luc和T7終止子串聯(lián)序列的pUC18質(zhì)粒。本傳感器對(duì)鉻的最短響應(yīng)時(shí)間為5分鐘，對(duì)鉻的最低檢測(cè)濃度為2.0微摩爾/升，最高檢測(cè)濃度為200微摩爾/升，具有靈敏度高，響應(yīng)速度快，成本低，操作簡單的特點(diǎn)，可廣泛運(yùn)用于污染環(huán)境鉻的檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102925401SQ20121046560
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者莊國強(qiáng), 侯啟會(huì), 馬安周, 崔萌萌, 王艷娟 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心