專利名稱：Pcr法檢測蠶卵中家蠶微粒子蟲的樣本處理方法及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物檢測技術領域，涉及一種PCR法檢測蠶卵中家蠶微粒子蟲的樣本處理方法及檢測方法。
背景技術：
家蠶微粒子蟲(Nosema bombycis Naegeli 1857)是家蠶微粒子病的病原。家蠶微粒子蟲是一種原生動物，當其在家蠶體內寄生時，以孢子形態(tài)出現(xiàn)最多，孢子為單細胞構造，通常為橢圓形，外包裹O. 5微米厚的孢子壁，孢子壁很堅韌，能耐弱酸和堿，對外界的抵抗力很強。家蠶微粒子病是一種全身性感染的慢性蠶病，病程較長，且在家蠶的各個發(fā)育階段都有不同的病征和病變，是毀滅性蠶病之一，被世界各養(yǎng)蠶國家確定為強制檢疫對象。1865 1970年,法國科學家巴斯德(Louis Pasteur)對家蠶微粒子病害進行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)微粒子原蟲是該病害的病原，并可通過食下和胚種兩個途徑感染家蠶。巴斯德建立了母蛾單蛾光學顯微鏡檢疫的技術方法，但隨著蠶種生產(chǎn)量的擴大，檢疫工作量大幅上升，單蛾光學顯微鏡檢疫技術無法適應生產(chǎn)需求。上世紀60年代，日本科學家建立了母蛾集團光學顯微鏡檢疫技術，我國在80年代的主要蠶區(qū)開始推廣應用至今。母蛾集團檢疫在一定程度上節(jié)省了檢疫時間和成本，但仍存在一些問題，其一是母蛾檢疫是一種產(chǎn)品的間接檢疫，在檢疫結果與產(chǎn)品的對應性上存在明顯缺陷；其二是光學顯微鏡在鑒別不同種類微孢子蟲或類似物時的能力十分有限。分子生物學技術的高速發(fā)展，為家蠶微粒子蟲的檢測提供了新的技術方法和手段，也使直接針對蠶卵進行檢疫成為了可能，科學家針對免疫學檢測技術和PCR檢測技術在家蠶微粒子蟲檢測中的應用進行了廣泛研究。現(xiàn)有免疫學技術特別是酶標技術和膠體金技術在技術上具備良好的商業(yè)化平臺，但由于家蠶微粒子蟲的大個體和高比重等特性，使其檢測的穩(wěn)定性和靈敏度等方面存在缺陷，難于在生產(chǎn)上應用。PCR檢測技術在家蠶微粒子蟲的檢測中可以避免免疫學技術所存在的上述問題，操作也較為容易，成本相對較低，但在實際應用過程中還存在著一定的缺陷。一般在PCR檢測過程中，都需要先提取待測樣本的核苷酸，而該過程因耗時較長，不適合生產(chǎn)中大批量樣本的檢測；通過對樣本進行煮沸的處理后直接進行LAMP技術，節(jié)省了核苷酸提取過程，簡單易行，但其過高的假陽性，特異性不佳，因而其只能應用于一般性病原蟲檢查而無法應用于檢疫性病原蟲；熒光定量PCR方法雖然具有很好的特異性和批量檢測的優(yōu)點，但仍然避免不了核苷酸的制備過程，檢疫成本相對較高。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種蠶卵樣本的處理方法，解決了現(xiàn)有PCR法檢測家蠶微粒子蟲需提取蠶卵樣本的核苷酸，耗時較長的問題。
一種蠶卵樣本的處理方法，包括將蠶卵樣本加入前處理液中，放置30min以上，搗碎蠶卵并調節(jié)溶液PH值為中性，制得PCR模板；所述前處理液為堿性且包含I IOmol/L的甜菜堿。所述蠶卵樣本可以是即時浸酸的蠶卵、或冷藏浸酸后的蠶卵、多化性蠶卵或自然越年蠶卵。堿性環(huán)境可以誘導家蠶微粒子蟲孢子發(fā)芽，彈出極絲，釋放孢原質及核酸，但強堿性環(huán)境不利于PCR的進行，因此需要將溶液pH值調節(jié)至中性；另外，加入甜菜堿可以一定程度上消除蠶卵成分會對PCR反應造成的干擾，優(yōu)選的，甜菜堿的濃度為5 8mol/L,最優(yōu)選的，甜菜堿的濃度為5mol/L。優(yōu)選的，所述前處理液包含O. 5 2mol/L的NaOH。由于蠶卵具有堅硬的外殼，家蠶微粒子蟲的孢子也有堅硬的孢子壁，兩者都不易破裂，氫氧化鈉可以軟化和崩解蠶卵外殼，更優(yōu)選的，所述NaOH的濃度為lmol/L。蠶卵在前處理液中的放置時間影響蠶卵的崩解率、微粒子蟲孢子的發(fā)芽率以及釋放核酸的量，所述放置時間優(yōu)選為30 120min,在這個時間范圍內，PCR結果差異不大。本發(fā)明還提供了一種檢測蠶卵中家蠶微粒子蟲的方法，包括(I)取蠶卵樣本，利用所述的處理方法對蠶卵樣本進行處理，獲得PCR模板；(2)設計特異性引物，利用步驟(I)獲得的PCR模板進行PCR擴增；(3)將PCR擴增產(chǎn)物電泳分離，染色成像，根據(jù)成像結果判定蠶卵樣本中是否含有家蠶微粒子蟲。擴增參數(shù)的選擇也有可能影響最終的檢測結果，本發(fā)明PCR擴增的參數(shù)優(yōu)選為預變性95°C，5min ;變性95°C，0. 5min，退火48. 3°C,O. 5min，延伸 72°C，lmin，循環(huán) 35 次;延伸 72°C，5min。本發(fā)明又提供一組檢測家蠶微粒子蟲的特異性引物，具體為正向引物5'-ATAAATCGGAGGGCAAAT-3'；反向引物5'-TAAGCCGCACAATCCAC-3'。該組引物根據(jù)家蠶微粒子蟲的高度保守的小亞基核糖體RNA基因設計。擴增片段長度為408bp，因此如果凝膠圖譜中出現(xiàn)408bp的條帶，則說明蠶卵樣本中攜帶家蠶微粒子蟲。本發(fā)明方法操作簡單，成本低，使整個檢測流程時間縮短40% (3小時)，可用于一般性的家蠶微粒子蟲檢測，更適合于樣本量較大的蠶卵(或蠶種、蠶蛹、蛾)家蠶微粒子蟲檢疫。


圖I為本發(fā)明實施例I中的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為核酸分子量標記；1為健康家蠶所產(chǎn)的蠶卵樣本；2、3、4、5和6分別為感染孢子濃度為103、104、IO5UO6和IO7個/mL家蠶微粒子蟲的家蠶所產(chǎn)的蠶卵樣本；圖2為本發(fā)明實施例2中的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為核酸分子量標記；0和I為健康蠶卵中混入I. O μ L孢子濃度為IO9個/mL家蠶微粒子蟲的2個樣本；3和5為健康蠶卵中混入I. O μ L孢子濃度為IO7個/mL家蠶微粒子蟲的2個樣本；7和9為健康蠶卵中混入I. O μ L孢子濃度為IO5個/mL家蠶微粒子蟲的2個樣本；圖3為本發(fā)明實施例3中的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為核酸分子量標記；1、2、3、4、5、6、7、8、9和10均為感染孢子濃度為IO4個/mL家蠶微粒子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵中的死卵樣本； 圖4為本發(fā)明實施例4和實施例5中的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為核酸分子量標記；1、2、3和4為感染孢子濃度為IO4個/mL家蠶微粒子蟲的家蠶的幼蟲中腸樣本；A1、A2、A3和A4為感染孢子濃度為IO8個/mL家蠶微粒子蟲的家蠶蠶蛹樣本；B1、B2、B3和B4為感染孢子濃度為IO8個/mL家蠶微粒子蟲的家蠶母蛾樣本；C1、C2、C3和C4是4個健康母蛾樣本。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步闡釋。實施例I感染家蠶微粒子蟲的蠶卵檢測(I)引物設計針對家蠶微粒子蟲的小亞基核糖體RNA基因(N bombycis SSU rRNAFJ854546. I)為靶向，設計特異性引物，擴增片段的長度為408bp，其中正向引物(NB-SSU599F)5/ -ATAAATCGGAGGGCAAAT-3'；反向引物(NB-SSU599R)5/ -TAAGCCGCACAATCCAC-3'。(2)樣本準備及處理感染家蠶微粒子蟲的次代蠶卵的準備常規(guī)飼養(yǎng)蠶種，5齡起蠶后，按照每頭家蠶100 μ L家蠶微粒子蟲孢子液的劑量，進行不同家蠶微粒子蟲孢子濃度(孢子濃度分別為
103、104、IO5UO6和IO7個/mL)的舔食，4小時內食盡，接著進行常規(guī)飼養(yǎng)、上蔟、羽化、交配(交配時用的雄蛾為健康個體)和產(chǎn)卵，交配后產(chǎn)下的卵即為次代蠶卵，將蠶卵即時浸酸。將即時浸酸的蠶卵置于25°C和相對濕度為80%的培養(yǎng)箱內放置10天，取轉青的蠶卵，放入PCR管，加入5 μ L的樣本前處理液(含I. OmoI/L氫氧化鈉和5. OmoI/L甜菜堿)，加蓋，25°C放置120min,用50 μ L槍頭搗碎蠶卵，加入5 μ L lmol/L鹽酸，加蓋放置，用于PCR擴增，當天用畢即可。
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(3) PCR擴增
在步驟(2)中得到的含處理過的蠶卵樣本的PCR管內中，加入下列試劑IOXbuffer5 μ L
(含Tris-HCl，100mmol/L ；KC1, 500mmol/L ；MgCl2,15mmol/L)
dNTP2 μ L
(dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 分別為 2. 5mmol/L
權利要求
1.一種蠶卵樣本的處理方法，其特征在于，包括將蠶卵樣本加入前處理液中，放置30min以上，搗碎蠶卵并調節(jié)溶液pH值為中性，制得PCR模板；所述前處理液為堿性且包含I 10mol/L的甜菜堿。
2.如權利要求I所述的處理方法，其特征在于，所述甜菜堿濃度為5 8mol/L。
3.如權利要求2所述的處理方法，其特征在于，所述甜菜堿濃度為5mol/L。
4.如權利要求I所述的處理方法，其特征在于，所述放置的時間為30 120min。
5.如權利要求I所述的處理方法，其特征在于，所述前處理液包含O.5 2mol/L的NaOH。
6.如權利要求5所述的處理方法，其特征在于，所述前處理液包含lmol/L的NaOH。
7.如權利要求I所述的處理方法，其特征在于，所述調節(jié)溶液pH值的試劑為鹽酸。
8.一種蠶卵中家蠶微粒子蟲的檢測方法,包括 (1)取蠶卵樣本，利用權利要求I 5任一所述的處理方法對蠶卵樣本進行處理，獲得PCR模板； (2)設計特異性引物，利用步驟(I)獲得的PCR模板進行PCR擴增； (3)將PCR擴增產(chǎn)物電泳分離，染色成像，根據(jù)成像結果判定蠶卵樣本中是否含有家蠶微粒子蟲。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述特異性引物為 正向引物5' -ATAAATCGGAGGGCAAAT-3'； 反向引物5' -TAAGCCGCACAATCCAC-3'。
10.如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的參數(shù)為預變性95°C，5min ;變性 95。。，O. 5min,退火 48. 3 °C, O. 5min,延伸 72°C，lmin，循環(huán) 35 次；延伸 72。。，5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種PCR法檢測蠶卵中家蠶微粒子蟲的樣本處理方法，包括將蠶卵樣本加入前處理液中，放置30min以上，搗碎蠶卵并調節(jié)溶液pH值為中性，制得PCR模板；所述前處理液為堿性且包含1～10mol/L的甜菜堿。另外，本發(fā)明還提供了一種運用上述的樣本處理方法檢測蠶卵中家蠶微粒子蟲的方法。本發(fā)明方法操作簡單，成本低，使整個檢測流程時間縮短40％，可用于一般性的家蠶微粒子蟲檢測，更適合于樣本量較大的蠶卵(或蠶種、蠶蛹、蛾)家蠶微粒子蟲檢疫。
文檔編號C12Q1/68GK102925583SQ20121046568
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權日2012年11月16日
發(fā)明者魯興萌, 蔡順風, 李明乾, 馬煥艷, 何永強, 李光才 申請人:浙江大學