專利名稱：一種漆酶基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
一種漆酶基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種漆酶基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三苯甲烷類染料是一種多苯環(huán)化合物，使用面較廣，用量也較大，其產(chǎn)量被列為第三大主要染料。其中某些染料及中間降解產(chǎn)物具有“三致”作用。且這類染料中的一部分難以降解，常常導致常規(guī)的生物處理系統(tǒng)處理效果不夠理想。行之有效的染料廢水處理方法和技術(shù)是改善生態(tài)環(huán)境、保證食品安全和維護人類健康的重要保證。生物法即通過篩選或構(gòu)建具有高效性能的特定微生物菌株用于染料廢水的脫色，是一種經(jīng)濟、有效且適于大規(guī)模廢水處理的技術(shù)。
生物方法對染料的脫色主要通過降解和生物吸附兩方面發(fā)揮作用，降解是由微生物分泌胞外氧化酶-木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)進行脫色，包括漆酶、木素過氧化物酶和錳過氧化物酶等；而吸附主要是通過菌體的自身結(jié)構(gòu)與染料等大分子物質(zhì)相契合所致。因此，對用于染料的生物脫色方法通常以微生物和酶為載體進行研究。
目前研究發(fā)現(xiàn)的染料脫色酶主要有漆酶(Laccase)、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)，它們對底物的降解具有廣譜性，對染料的脫色及降解效果明顯，具有很好的應(yīng)用前景。漆酶是一類含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于自然界中，主要包括植物漆酶和真菌漆酶，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和細菌基因組序列分析的結(jié)果證明漆酶也廣泛存在于細菌中。 漆酶作為一種生物制劑，具有高效、專一、作用條件溫和等特點，在紙漿生物漂白、染料的脫色及其廢水凈化、污染物質(zhì)脫毒與降解等方面有著巨大的應(yīng)用潛力。而且，在還原介質(zhì)的存在下，可進一步的擴大漆酶的底物范圍。采用漆酶直接對染料進行脫色降解，以及利用漆酶介體系統(tǒng)，漆酶染料中間體和固定化漆酶對染料降解的研究已引起了國內(nèi)的脫色降解效果。然而，大量關(guān)于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于擔子菌門 (Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)及半知菌類(Imperfect fungi)等真菌，其中最 主要的是擔子菌門中的白腐真菌。但是真菌較細菌生長緩慢、發(fā)酵周期長、生長溫度和PH 范圍狹窄等特性，必然導致真菌在產(chǎn)酶數(shù)量、酶學性質(zhì)等多方面體現(xiàn)出劣勢。細菌漆酶比真菌漆酶有更多的優(yōu)點，如存在Cu2+抗性、不需糖基化、熱穩(wěn)定性好及酶活性的最適pH值范圍廣等。因此，細菌漆酶的研究對漆酶應(yīng)用的環(huán)境條件和領(lǐng)域的擴展具有十分重要的意義。 而目前關(guān)于細菌漆酶的研究很少，更多具有高效脫色能力細菌漆酶及其基因有待于進一步發(fā)掘和研究。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)有缺陷，提供一種漆酶基因及其克隆方法。
本發(fā)明的另一目的是提供該漆酶基因生產(chǎn)重組漆酶的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供該漆酶基因的應(yīng)用
本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
一種漆酶基因fmb_L103，其開放閱讀框序列如SEQ ID NO.1所示。
本發(fā)明所述的漆酶基因fmb-L103編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所/Jn ο
本發(fā)明所述的漆酶基因fmb-L103的克隆方法，提取死亡谷芽孢桿菌 (BaciIlusvallismortis)fmb-103菌株基因組,根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中已登錄的芽孢桿菌漆酶基因No.⑶972592.1設(shè)計引物對F-1/R-1，從fmb_103菌株基因組中擴增獲得SEQ ID NO.1所示的漆酶基因開放閱讀框；其中所述的死亡谷芽孢桿菌fmb-103，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年06月08日，保藏號為CGMCC No. 6198 ;所述的引物對序列為F-1 SEQ ID NO. 3，R-1 SEQ ID NO. 4。
一種生產(chǎn)重組漆酶fmb_rL103的方法，包含以下步驟
(I)克隆權(quán)利要求1所述的漆酶基因；
(2)漆酶基因原核表達載體構(gòu)建；
(3)重組漆酶在大腸桿菌中的表達。
其中，所述的克隆權(quán)利要求1所述的漆酶基因包含以下步驟(I)提取保藏號為 CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103的基因組DNA ；⑵以F-2和R-2為上、下游引物， fmb-103的基因組DNA為模板，PCR擴增漆酶基因；(3)回收純化目標PCR產(chǎn)物；其中，所述的引物F-2序列為SEQ ID NO. 5，引物R-2序列為SEQ ID NO. 6。
所述的漆酶基因原核表達載體構(gòu)建是將上一步純化所得的目標PCR產(chǎn)物與原核表達載體pET-23a連接得到重組載體pET-23a-fmb-L103。
本發(fā)明所述的漆酶基因fmb_L103在三苯甲烷類染料脫色中的應(yīng)用。
其中，所述的三苯甲烷類染料優(yōu)選孔雀石綠、亮綠或苯胺藍中的任意一種或多種。
按照本發(fā)明所述的方法生產(chǎn)的重組漆酶fmb-rL103在三苯甲烷類染料脫色中的應(yīng)用。
其中，所述的三苯甲烷類染料為孔雀石綠、亮綠或苯胺藍中的任意一種或多種。
有益效果
本發(fā)明人從已篩選到的具芽孢漆酶活性的死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) fmb-103基因組中，克隆獲得一種新型的原核漆酶基因fmb_L103,并實現(xiàn)了在大腸桿菌表達宿主菌BL21 (DE3)pLysS的異源高效表達。重組酶fmb_rL103可高效地催化三苯甲烷類染料孔雀石綠、亮綠、苯胺藍的降解。


圖1重組fmb-103漆酶基因表達載體構(gòu)建過程
圖2重組fmb-103漆酶fmb_rL103對孔雀石綠、亮綠、苯胺藍的降解效果圖
其中，CK.染料；A.漆酶+染料；B. ABTS+染料；C. 丁香醛+染料；D.乙酰丁香酮+ 染料；E. fmb-rL103+ABTS+ 染料；F. fmb_rL103+ 丁香醛 + 染料；G. fmb-rL103+ 乙酰丁香酮 + 染料。
生物材料保藏信息
死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)fmb-103,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期為2012年06月08日，保藏號為CGMCC No. 6198。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
實施例1:死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) fmb-103漆酶基因的克隆
離心收集死亡谷芽抱桿菌(Bacillusvallismortis) fmb-103 菌體(CGMCC No. 6198)，用上海生工基因組DNA提取試劑盒提取死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) fmb-103 的基因組 DNA。
根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中已登錄的芽孢桿菌漆酶基因(No.⑶972592.1)設(shè)計兩個引物
上游引物F-1 :5’-ATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3’ (SEQ ID NO. 3)；
下游引物R-1 :5，-TTATTTATGGGGATCAGTTATATC-3，(SEQ ID NO. 4)；
在50 μ I體系中，引物終濃度各為ΙμΜ，dNTPs終濃度為O. 2mM，fmb-103菌株基因組 DNA10ng，2U Pfu DNA 聚合酶。擴增程序為 94°C 3min ;30X (94°C 40s，53°C 50s， 72°C 90s) ；72°C IOmin0瓊脂糖凝膠電泳，切膠，采用上海生工試劑盒回收，將回收的PCR產(chǎn)物與 TaKaRapMD 19-simp Ie-T vector 連接，轉(zhuǎn)化 Ε· coli DH5 α，涂 于含有 IPTG、X_gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時，挑白色菌落，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，確定連接成功后送到上海生工測序，用計算機軟件DNAMAN分析測序結(jié)果，得到一個序列如SEQ ID NO.1 所示的長度為1542bp的ORFJP fmb-103漆酶基因(fmb_L103)，編碼一個由514個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，序列如SEQ ID NO. 2所示。
實施例2 :死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶基因原核表達載體的構(gòu)建(附圖1)
根據(jù)獲得的漆酶基因序列，設(shè)計兩個引物，上游引物加上SacI識別序列，下游引物加上XhoI識別序列(下劃線部分為限制酶識別序列)
上游引物F-2:5'-CGCGAGCTCATGACACTTGAAAMTTTGTGGATGC~3/ (SEQ ID NO. 5),
下游引物R_2:5' ~CCGCTCGAGTTATTTATGGGGATCAGTTATATC~3/ (SEQ ID NO. 6)，
按照下列PCR體系加入各成分，擴增LOX基因
10XF/y PCR buffer10 μ M上游引物 10 μ M下游引物 2. 5mM dNTPs fmb-103菌株基因組DNA ddH3010 μ I 10 μ I 10μ I 8μ I IOng up to 100 μ IPfu DNA聚合酶5U
PCR 程序為94°C 3min ；30X (94°C 40s ；53°C 50s ；72°C 90s) ；72°C IOmin0
用上海生工PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，加Sac1、XhoI雙酶切，滅活，乙醇沉淀，ddH20重溶，與適量的用相同限制酶消化的載體pET_23a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取幾個菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒，電泳，以電泳滯后的質(zhì)粒為模板進行PCR驗證，確定連接成功后送到上海生工測序。
實施例3 :死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)fmb_103漆酶基因在大腸桿菌中的表達
將含有fmb_L103表達質(zhì)粒pET-23a-fmb-L103轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主菌株 BL21 (DE3)pLysS，在37°C培養(yǎng)10-11小時后挑取小菌落，接入含有氨芐青霉素的50ml LB液體培養(yǎng)基，70-90rpm 30°C培養(yǎng)過夜，按照1:40的體積比取種子液加入到含有氨芐青霉素的100ml LB液體培養(yǎng)基，350C 180rpm振蕩2_3小時至0D600約為O. 6時加IPTG (終濃度 100yg/ml)誘導。1. 5小時后離心收集菌體。破碎菌體，離心收集上清液，獲得重組死亡谷芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)漆酶(fmb_rL103)的粗酶液。
漆酶活性測定采用2，2’ -連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)法稍作改動反應(yīng)體系總體積3mL，包括2. 45mL O. 2mol/L pH 5. O檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、O. 5mL 6mmol/L ABTS及50 μ I用pH 5.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液適當稀釋的酶粗提液，45°C測定反應(yīng)的前3min內(nèi)反應(yīng)液在420nm處吸光值OD的增加量，以滅活酶液做空白對照。將每分鐘內(nèi)生成I μ mol反應(yīng)物所需的酶量定義為一個酶活力單位。漆酶酶活計算公式漆酶活力 (U)= V總 X AOD/(V mX ε X AtXl(Te) X 總酶酶液稀釋倍數(shù)；其中，ε =3. 6 X 104mol/cm ； At 3min ；A0D 3min內(nèi)吸光度OD的變化值；V@ :酶反應(yīng)中，反應(yīng)液的總體積;V酶:酶反應(yīng)中，酶液的體積。實驗重復3次，取平均值。
采用上述方法測得pET-23a-fmb_L103轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)pLysS后的工程菌，重組漆酶的產(chǎn)量為12000U/ml發(fā)酵液。
實施例4 :重組死亡谷芽抱桿菌(Bacillus vallismortis) fmb-103漆酶 (fmb-rL103)的分離純化
采用NTA (鎳柱，GE公司產(chǎn)品)親和層析法對實例3中獲得的fmb_rL103粗酶液進行分離純化。樣品中加5mM咪唑(終濃度)，增強吸附柱。
上樣前，用20mM咪唑平衡層析柱。樣品過三次柱材料，達到fmb_rL103與親和柱材料充分結(jié)合的目的。
上樣結(jié)束后，用IOOmM咪唑洗脫(分別用10個柱床體積)，收集洗脫液測酶活。上述純化制備的重組漆酶fmb-rL103酶活為3. 6U/mg蛋白。
實施例5 :重組漆酶(fmb_rL103)對染料的降解
fmb-rL103對染料的脫色能力采用比色法測定。測染料降解前后在最大吸收波長處的吸光值，苯胺藍、亮綠、孔雀石綠和靛藍的最大吸收波長分別為585nm、627nm和617nm。 降解前后的吸光值分別為Ap A2，其脫色率用下述公式計算
脫色率(％) = (A1-A2) /A1X 100%利用芽孢漆酶催化染料脫色降解的反應(yīng)體系總體積4mL,包括0. lmol/L的介體ABTS、丁香醒或乙酰丁香酮,0. 2mol/LpH6. O的醋酸-醋酸鈉緩沖液，5U/mL fmb-rL103和50mg/L的染料(雀石綠、亮綠或苯胺藍)，以不加酶為對照， 于37°C下靜置反應(yīng)48h。三種介體對脫色反應(yīng)效果圖如附圖2所示，重組fmb-103漆酶 fmb-rL103分別在與3種介質(zhì)(ABTS、丁香醛、乙酰丁香酮)共同作用下，對染料的脫色效率見表I。
表I
權(quán)利要求
1.一種漆酶基因fmb-L103，其特征在于其開放閱讀框序列如SEQ ID NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的漆酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.權(quán)利要求1所述的漆酶基因的克隆方法，其特征在于提取死亡谷芽孢桿菌(BaciIlusvallismortis)fmb-103菌株基因組,根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中已登錄的芽孢桿菌漆酶基因No.⑶972592.1設(shè)計引物對F-1/R-1，從fmb_103菌株基因組中擴增獲得SEQ IDNO.1所示的漆酶基因開放閱讀框；其中所述的死亡谷芽孢桿菌fmb-103，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年06月08日，保藏號為CGMCCNo. 6198 ;所述的引物對序列為F-1 SEQ ID NO. 3，R-1 SEQ ID NO. 4。
4.一種生產(chǎn)重組漆酶fmb-rL103的方法，其特征在于包含以下步驟 (1)克隆權(quán)利要求1所述的漆酶基因； (2)漆酶基因原核表達載體構(gòu)建； (3)重組漆酶在大腸桿菌中的表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)重組漆酶fmb-rL103的方法，其特征在于所述的克隆權(quán)利要求I所述的漆酶基因包含以下步驟⑴提取保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103的基因組DNA ；⑵以F-2和R-2為上、下游引物，fmb-103的基因組DNA為模板，PCR擴增漆酶基因；(3)回收純化目標PCR產(chǎn)物；其中，所述的引物F-2序列為SEQ IDNO. 5，引物 R-2 序列為SEQ ID NO. 6。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)重組漆酶fmb-rL103的方法，其特征在于所述的漆酶基因原核表達載體構(gòu)建是將上一步純化所得的目標PCR產(chǎn)物與原核表達載體pET-23a連接得到重組載體 pET-23a-fmb-L103。
7.權(quán)利要求1所述的漆酶基因在三苯甲烷類染料脫色中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的三苯甲烷類染料為孔雀石綠、亮綠或苯胺藍中的任意一種或多種。
9.按照權(quán)利要求4所述的方法生產(chǎn)的重組漆酶fmb-rL103在三苯甲烷類染料脫色中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的三苯甲烷類染料為孔雀石綠、亮綠或苯胺藍中的任意一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種漆酶基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用。一種漆酶基因fmb-L103，其開放閱讀框序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明所述的漆酶基因fmb-L103編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明所述的漆酶基因fmb-L103在三苯甲烷類染料脫色中的應(yīng)用。本發(fā)明人從已篩選到的具芽孢漆酶活性的死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)fmb-103基因組中，克隆獲得一種新型的原核漆酶基因fmb-L103，并實現(xiàn)了在大腸桿菌表達宿主菌的異源高效表達。重組酶fmb-rL103可高效地催化三苯甲烷類染料孔雀石綠、亮綠、苯胺藍的降解。
文檔編號C12N15/10GK102994524SQ201210466079
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者陸兆新, 張充, 呂鳳霞, 別小妹 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學