一種溶藻弧菌的pcr檢測(cè)引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種溶藻弧菌(Vibrio?alginolyticus)PCR檢測(cè)引物。本發(fā)明提供的檢測(cè)引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和2所示。本發(fā)明還提供含有所述引物的PCR檢測(cè)試劑盒、和引物的使用條件、檢測(cè)方法。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)特異性好,靈敏度高,非常適用于檢測(cè)海產(chǎn)品中的溶藻弧菌。
【專利說(shuō)明】—種溶藻弧菌的PCR檢測(cè)引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及海產(chǎn)品疾病檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及海產(chǎn)品致病微生物檢測(cè)方法，尤其是一種溶藻弧菌PCR檢測(cè)引物。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)海域遼闊，自然條件優(yōu)越，海洋資源十分豐富。但目前開發(fā)利用的程度還很低。這也說(shuō)明我國(guó)開發(fā)利用海洋資源的潛力巨大，遼寧海域是中國(guó)重要的海洋生物資源、漁業(yè)資源寶庫(kù)，其盛產(chǎn)海參、扇貝、貽貝、牡蠣和魚、蝦以及藻類等，帶動(dòng)海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展。加強(qiáng)多邊和雙邊的海洋開發(fā)國(guó)際合作，集中集約開發(fā)利用海域及海島資源，合理配置優(yōu)勢(shì)海洋產(chǎn)業(yè)，科學(xué)高效開發(fā)海洋資源，積極開展科研與試驗(yàn)、開發(fā)與利用，海水養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)化是合理開發(fā)海水養(yǎng)殖資源的重要手段，研究制定海產(chǎn)品養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)，合理開發(fā)海水灘涂養(yǎng)殖資源，提高養(yǎng)殖海產(chǎn)品疾病是當(dāng)今養(yǎng)殖業(yè)的重點(diǎn)內(nèi)容。
[0003]海產(chǎn)品養(yǎng)殖是一項(xiàng)高風(fēng)險(xiǎn)的養(yǎng)殖業(yè)，傳統(tǒng)的小戶的海產(chǎn)品養(yǎng)殖給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的市場(chǎng)和技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。為了將養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)降到最低，開展對(duì)各類養(yǎng)殖業(yè)，包括魚、蝦、蟹、海參、鮑魚、貝類、海藻等各類海產(chǎn)品的疾病防治工作任務(wù)舉足輕重。有報(bào)道稱，霍亂弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌等有害細(xì)菌，是引起海產(chǎn)品各種疾病的罪魁禍?zhǔn)住?br> [0004]其中，殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonida、中間氣單胞菌Aeromonas media和?；【镒兎NI Vibro pelagius biovar I均可引起刺參表皮潰爛病,癥狀為:發(fā)病初期，病參有搖頭現(xiàn)象，圍口腔膜松弛，觸手對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，繼而出現(xiàn)排臟現(xiàn)象；發(fā)病中期，刺參口腹部出現(xiàn)小面積潰爛，形成小白斑，潰爛面積逐漸增大，口部腫大，不能收縮與閉合，逐漸失去攝食能力；發(fā)病末期，刺參體表大面積潰爛，身體收縮，溶解成粘膠狀。
`[0005]假交替單胞菌Psevdoalteromonas nigrifaciens可導(dǎo)致保苗期腐皮綜合征:病參首先口部腫大，觸手不能完全合攏；然后口部出現(xiàn)潰爛白斑，直至參體大面積潰爛，導(dǎo)致最終死亡。
[0006]燦爛弧菌Vibrio splendidus可導(dǎo)致耳狀幼體爛胃病、幼參急性口圍腫脹癥和養(yǎng)成期刺參腐皮綜合征等。發(fā)病癥狀:幼體:在顯微鏡下可見耳狀幼體胃壁增厚、萎縮、潰爛。幼參:活力下降，身體萎縮，口圍腫脹，排臟，體表潰爛，管足松弛失去附著力，脫落至池底，最后死亡。養(yǎng)成期:首先觸手過(guò)度伸張，逐步失去伸展活力，口部腫大，體表分泌粘液增多；然后，口部出現(xiàn)潰爛白斑，從小到大。嚴(yán)重者身體發(fā)生潰爛，最終導(dǎo)致死亡。
[0007]弧菌Vibro tapetis和病菌Marinomonas dokdonensis均可導(dǎo)致幼參急性口圍腫脹癥:病參活力下降，身體萎縮，口圍腫脹，排臟，體表潰爛，管足松弛失去附著力，脫落至池底，最后死亡?；【鶹ibrio Ientus還可導(dǎo)致耳狀幼體爛邊病:在顯微鏡下可見耳狀幼體邊緣突起處組織增生，顏色加深變黑，邊緣變得模糊不清，逐步潰爛，最后整個(gè)幼體解體消失。存活個(gè)體的發(fā)育遲緩、變態(tài)率低，即使幼體能變態(tài)附板I周左右也大多“化板”消失。
[0008]藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和燦爛弧菌(V.splendidus)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常見的致病菌，對(duì)水生動(dòng)物包括魚類、雙殼貝類、甲殼類和棘皮動(dòng)物等的養(yǎng)殖造成了巨大的損失，溶藻弧菌對(duì)人的臨床感染也屢見報(bào)道，燦爛弧菌還可作為致病微生物之一；
[0009]世界海參養(yǎng)殖以刺參(溫帶種)和糙海參(熱帶種)為主要品種。除中國(guó)、日本、韓國(guó)主要養(yǎng)殖刺參外，其他國(guó)家均以糙海參為主要養(yǎng)殖對(duì)象。近年來(lái)，隨著自然資源的減少和消費(fèi)需求的增加，海參的人工養(yǎng)殖在一些國(guó)家逐漸興起。其中，中國(guó)和日本是主要的養(yǎng)殖國(guó)家，印度、印度尼西亞、越南、菲律賓、韓國(guó)、埃及等也有小規(guī)模的增養(yǎng)殖。
[0010]刺參(Apostichopus japonicus)是我國(guó)有記載的20余種食用海參中價(jià)值最高、惟一分布于黃渤海域的溫帶種。其蛋白質(zhì)含量高，糖類豐富，脂類含量低，且不含膽固醇，具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值，被人們視為重要的海珍品，因而具有重要的市場(chǎng)價(jià)值。近年來(lái)，海參消費(fèi)需求量的逐年增加導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)海參自然資源的過(guò)度開發(fā)和種群數(shù)量的急劇下降，因此，海參的人工養(yǎng)殖也隨之發(fā)展起來(lái)。隨之而來(lái)的是海參養(yǎng)殖中遇到的各類問題。
[0011]其中，海參腐皮綜合癥，該癥也稱“皮膚潰爛病”，“化皮病”，是當(dāng)前養(yǎng)殖刺參最常見的疾病，危害最為嚴(yán)重。越冬保苗期幼參和養(yǎng)成期海參均可被感染發(fā)病，但幼參的感染率、發(fā)病率和死亡率都高于成參，感染率很高，一旦發(fā)病很快就會(huì)蔓延至全池，死亡率可達(dá)九成以上，屬急性死亡。每年的1-3月份養(yǎng)殖水體溫度較低時(shí)(8°C以下)是發(fā)病高峰。感染初期病灶部位以假單胞菌屬的和燦爛弧菌為優(yōu)勢(shì)菌，感染后期由于刺參表皮受細(xì)菌的侵襲腐蝕作用形成體表創(chuàng)傷面，易于使霉菌和寄生蟲富集和生長(zhǎng)造成繼發(fā)性感染，加劇海參的死亡速度。
[0012]溶藻弧菌病是指由各種類型溶藻弧菌所引起的對(duì)人類、以及海洋生物等不同形式的總稱。溶藻弧菌可引起刺參潰瘍病，發(fā)病癥狀為:患病刺參體表潰瘍，粘液增多，吐腸，1/4出現(xiàn)腫嘴，最后自溶死亡。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae),弧菌屬(Vibrio),革蘭氏陰性短桿菌,無(wú)芽孢、莢膜，單獨(dú)存在或尾端相連成“C”或“S”形，為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧海生弧菌，適宜溫度為17~35°C。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)作為一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛存在于世界各地海水和海產(chǎn)品中，是許多海水養(yǎng)殖動(dòng)物的`致病菌。近年來(lái)在養(yǎng)殖生產(chǎn)上出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的耐藥性現(xiàn)象，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了很大的危害，這很可能與溶藻弧菌生物被膜的形成有關(guān)。溶藻弧菌還能引起人類食物中毒。溶血毒素、耐熱性腸毒素(ST)和不耐熱性腸毒素(LT)是致病性微生物中常見的致病因子。
[0013]因此，由溶藻弧菌引起的海洋生物疾病問題是常見的，而目前檢測(cè)溶藻弧菌的方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用較高，不利于在基層單位推廣使用。為了使得海產(chǎn)品因細(xì)菌引起的各種疾病有很好的預(yù)防和檢測(cè)，需要有新的方法能夠在一個(gè)短的時(shí)間內(nèi)，在一個(gè)給定的樣品量中檢測(cè)病原體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本研究的目的是:建立一個(gè)新的檢測(cè)海產(chǎn)品中的病原體的方法。為達(dá)到直接在海產(chǎn)品中溶藻弧菌(Vibrio alginoyticus)檢測(cè)的目的。本發(fā)明采用Primer Express 1.5軟件中設(shè)計(jì)的引物，提供一種溶藻弧菌PCR檢測(cè)引物，其為:
[0015]上游引物:5，aggtctaaaagcagtcgc 3，, SEQ ID N0.1。[0016]下游引物:5，aacacttgttgtacgcac 3， SEQ ID N0.2。
[0017]其中，所述的引物擴(kuò)增片段為499bp左右的片段，根據(jù)電泳結(jié)果，即可判斷為是否存在病原體基因。
[0018]本發(fā)明還提供含有上述引物的溶藻弧菌PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒還可包括PCR緩沖液、dNTPs、純化水和Taq DNA聚合酶等。
[0019]本發(fā)明還提供應(yīng)用上述的試劑盒在海產(chǎn)品中檢測(cè)溶藻弧菌的方法，其包括:
[0020]I)提取海產(chǎn)品中的DNA ；
[0021]2)以步驟I提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0022]3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。
[0023]其中，上文涉及到PCR擴(kuò)增的步驟中，所述的PCR反應(yīng)體系為:每20 μ I的反應(yīng)液中，含有:(1)引物上、下游各 15mM, 100μ I ;⑵ 10XPCR 緩沖液，1.5ml ； (3) IOmM dNTPs,
1.5ml ； (5) 5U/ μ I Taq DNA 聚合酶，100 μ I ； (4)純化水，3.0ml。
[0024]其中，所述的PCR反應(yīng)條件為:951:預(yù)變性11^11，951:變性308，601:退火508，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
[0025]取5~10 μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)，電壓為90V，電泳時(shí)間為40min，然后觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)499bp左右的特異性片段。
[0026]本發(fā)明中，上述檢測(cè)試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測(cè)試劑盒中的其他緩沖液等成分 ，因其可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)確定，并通過(guò)配置或商業(yè)途徑購(gòu)買獲得，檢測(cè)試劑盒的使用方法和檢測(cè)條件，技術(shù)人員可以依據(jù)實(shí)施例中所列條件做參考依據(jù)進(jìn)行調(diào)整。這些關(guān)于制劑方式和方法的選擇，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從現(xiàn)有技術(shù)中得到充分的啟示，本發(fā)明不再贅述。
[0027]本發(fā)明公開了一種檢測(cè)海產(chǎn)品中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的引物和試劑盒。以及所述引物在檢測(cè)水體中、海產(chǎn)品、海產(chǎn)品飼料中的溶藻弧菌檢測(cè)方面的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)海產(chǎn)品中的溶藻弧菌，DNA最低檢測(cè)濃度為5ng，而且與其他細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好，同時(shí)樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，樣品檢測(cè)成本低于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，而且本發(fā)明試劑保存時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)污染。本發(fā)明對(duì)解決大批量樣品的溶藻弧菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為引物特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。I =DNAMarker ；2:溶藻弧菌；3:陰性對(duì)照；
[0030]圖2為細(xì)菌菌數(shù)系列稀釋的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。1:DNAMarker ；2:陰性對(duì)照，5ng梯度稀釋的樣品、IOng梯度稀釋的樣品、20ng梯度稀釋的樣品、40ng梯度稀釋的樣品、80ng梯度稀釋的樣品。
[0031]圖3為同時(shí)對(duì)溶藻弧菌菌株和對(duì)照菌株(大腸桿菌、葡萄球菌)進(jìn)行PCR檢測(cè)的電泳分析圖。1:DNA Marker ;2:溶藻弧菌菌株擴(kuò)增的結(jié)果，3.陰性對(duì)照(水)4.葡萄球菌菌株擴(kuò)增的結(jié)果；5.大腸桿菌菌株擴(kuò)增的結(jié)果；
【具體實(shí)施方式】[0032]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0033]實(shí)施例1
[0034](一)菌種篩選
[0035]取樣品野生刺參體表的剖刮樣品，研磨成糊狀后，于LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)24h。24h后在LB血瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線接種。36.5°C培養(yǎng)24h后挑菌，3個(gè)黃色單菌落分別斜面接種，于35°C培養(yǎng)24h。分明經(jīng)過(guò)革蘭氏染色檢驗(yàn)，取呈陰性的菌種進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。
[0036]檢測(cè)前，用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)法檢測(cè)，菌體為IO81g CFU/mL。
[0037](二)樣品處理
[0038]于無(wú)菌離心管中取菌體為IO81g CFU/mL的樣品用無(wú)菌生理鹽水沖洗三次；再于每個(gè)50mL離心管裝5ml樣品:10mL洗脫液I充分混合，4°C下1000rpm離心lOmin，保留下層清澈液，并1000Orpm離心lmin,收集沉淀待測(cè)；其中洗脫液1:磷酸二氫鉀:0.27g,磷酸氫二鈉:1.42g，氯化鈉:8g，氯化鉀:0.2g，加去離子水約700mL充分?jǐn)嚢枞芙猓缓蠹尤?%的CTAB溶液，用鹽酸調(diào)pH至7.4，定容到1L。
[0039]每Ig沉淀物中加IOOuL 20mg/mL溶菌酶和500uL裂解液，于37 V水浴酶解30mirT2h。其中，裂解液:3mL液體中含有體積比為2%的CTAB溶液，體積比為0.2%的β -巰基乙醇，加入 30uL 蛋白酶 K。其中，CTAB 溶液:100mmol/L Tris-Hcl，20mmol/L 的 EDTA，1.4mol/L 的 NaCl。
`[0040]向獲得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脫液II，混勻后12000rpm離心IOmin ;其中，洗脫液I1:異戊醇:氯仿的體積比為1:24。
[0041]吸取上清500uL加入洗脫液II 500uL,混勻后12000rpm離心IOmin ；
[0042]吸取上清400uL加入無(wú)水乙醇800uL，混勻后_20°C靜置20min，12000rpm離心IOmin ；
[0043]沉淀用體積比為70%的乙醇洗滌3次，晾干后溶于50uL超純水或30uL I X TE溶液中，-20°C條件下貯存。其中，其中，上文所述pH8.0的TE緩沖液組成:10mM Tris-HCl,ImM EDTA (乙二胺四乙酸)
[0044]配制500ml 的 ρΗ8.0 的 TE 緩沖液的方法:量取 5ml IM Tris-HCl PH=8.0 和 Iml
0.5MEDTA PH=8.0的溶液于500ml燒杯中，向燒杯中加入約400ml蒸餾水均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存。
[0045](三)PCR擴(kuò)增
[0046]取5 μ L上述方法提取的DNA，用作PCR的模板DNA。根據(jù)文獻(xiàn)中基因保守序列設(shè)計(jì)上下游引物，擴(kuò)增片段大小為499bp，分別為:
[0047]上游引物:5，aggtctaaaagcagtcgc 3，, SEQ ID N0.1。
[0048]下游引物:5，aacacttgttgtacgcac 3， SEQ ID N0.2。
[0049]引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。使用德國(guó)EppendorfPCR擴(kuò)增儀，擴(kuò)增出細(xì)菌16S rDNA電泳圖，PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性5min ；94°C 30s, 55°C 30s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。
[0050]對(duì)以上鑒定出的細(xì)菌進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物按PCR產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書操作純化PCR產(chǎn)物，測(cè)序，基因序列用DNAStar軟件分析知，序列總長(zhǎng)499bp，將所得序列Blast分析顯示，證實(shí)基因序列與溶藻弧菌(V.alginolyticus)的同源性最高，其與AY332570菌株的同源性達(dá)到99%。
[0051]實(shí)施例2
[0052]溶藻弧菌的PCR檢測(cè)試劑盒，包括:
[0053](I)引物上、下游各 15mM，100 μ I。(2) 10XPCR緩沖液(含Mg2+20mM)，1.5ml。(3)dNTPs (IOmM)，1.5ml。(4)純化水，3.0ml。(5) Taq DNA 聚合酶(5U/μ I)，100 μ I。
[0054]放入0.2ml的離心管中，把提取的菌體DNAl μ I加入上述體系中，總體積為20 μ 1，離心混勻后置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0055]PCR 擴(kuò)增條件為:94°C變性 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。
[0056]取5 μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)，電壓為110V，電泳時(shí)間為35min，然后觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)預(yù)期的DNA特異性片段。結(jié)果表明，在499bp左右出現(xiàn)I條特異的條帶，而陰性對(duì)照則無(wú)條帶出現(xiàn)。
[0057]實(shí)驗(yàn)例3
[0058]分別計(jì)算原料樣品，取摻入溶藻弧菌0.fl%的各類海產(chǎn)品(罐頭、干貨)，按照下述方法，提取樣品DNA:
[0059]米用Qiagen 公司的DNA提取試劑盒(Qiagen Blood&Cell Culture DNA Maxi Kit,貨號(hào)13362)，并按其操作說(shuō)明提取基因組DNA。制備核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0060](I)取細(xì)菌增菌培養(yǎng)液IOOmL,加到500mL無(wú)菌離心管中，4000g,4°C離心15min ；
[0061](2)吸棄上清，取沉淀lmL，加TE溶液(pH8.0) 10mL，懸浮，加0.5mL 100g/L十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 50 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL),混勻，37°C溫浴Ih ；
[0062](3)加 2mL NaCl (5mol/L)，混勻，加 1.5mL CTAB-NaCl 混合溶液(100g/L CTAB 和
0.7mol/LNaCl)，混勻，65°C溫浴 20min ；
[0063](4)取上清，加等體積酚-氯仿-異戊醇混合液，(混合液中酚:氯仿:異戊醇的體積比為25:24:1)，混勻，6000g離心IOmin ；
[0064](5)取上清，加等體積氯仿-異戊醇混合液(混合液中氯仿:異戊醇的體積比為24:I )，混勻，6000g 離心 IOmin ；
[0065](6)取上清，加0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻，13000g離心IOmin ；
[0066](7)取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL TE溶液(pH8.0)溶解，此即為細(xì)菌基因組核酸溶液。置于_20°C備用。
[0067]DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算其濃度。將提取的DNA模板進(jìn)行適度稀釋，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm波長(zhǎng)下的OD值，DNA含量=OD260為50 μ g/ml (雙鏈DNA)，將其逐步稀釋，分別取I μ I為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，確定DNA最低檢測(cè)濃度為5ng，溶藻弧菌DNA樣品稀釋后含量為5ng、10ng、20ng、40ng、80ng幾個(gè)梯度的樣品進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
[0068]溶藻弧菌的PCR檢測(cè)試劑盒，包括:
[0069](I)引物上、下游各 15mM，100 μ I。(2) 10XPCR緩沖液(含Mg2+20mM)，1.5ml。(3)dNTPs (IOmM)，1.5ml。(4)純化水，3.0ml。(5) Taq DNA 聚合酶(5U/μ I)，100 μ I。
[0070]放入0.2ml的離心管中，把提取的DNA I μ I加入上述體系中，總體積為20μ 1，離心混勻后置PCR儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng)。
[0071]反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性lmin，95°C變性30s，60°C退火50s，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
[0072]取5 μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)，電壓為110V，電泳時(shí)間為35min，然后觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)預(yù)期的DNA特異性片段。結(jié)果如圖2，表明，樣品濃度在5ng以上的泳道中，都能在499bp左右出現(xiàn)I條特異的條帶,而陰性對(duì)照則無(wú)條帶出現(xiàn)。
[0073]實(shí)驗(yàn)例4
[0074]以大腸桿菌、霍亂弧菌為對(duì)照菌，利用實(shí)施例1所述檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)溶藻弧菌菌株和對(duì)照菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖可知，引物只對(duì)溶藻弧菌(泳道3)出現(xiàn)PCR陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)照組(泳道4、5)未出現(xiàn)特異性片段，該引物顯示了良好的特異性。利用本發(fā)明所述的引物檢測(cè)樣品中的DNA，不但減少了引物用量，節(jié)約成本，而且縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。
[0075]實(shí)施例5
[0076]菌種的生化鑒定
[0077]待測(cè)菌種經(jīng)生理鹽水稀釋至約I X 109cfu/mL，用移液槍吸取0.05mL的菌液分別用070060弧菌科細(xì)菌生化鑒定盒進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表1，
[0078]表1.生化鑒定管結(jié)果
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) PCR檢測(cè)引物,其特征在于:堿基序列為SEQIDN0.1~2。
2.如權(quán)利要求1所述引物在檢測(cè)水體中、海產(chǎn)品、海產(chǎn)品飼料中的溶藻弧菌檢測(cè)方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/63GK103820533SQ201210466094
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月16日
【發(fā)明者】謝克煥 申請(qǐng)人:大連德通生物技術(shù)開發(fā)有限公司