專利名稱：一種赤霉菌及發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素GA₄₊₇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，主要涉及的是對本實(shí)驗(yàn)室篩選到的一株產(chǎn)赤霉素ga4+7的赤霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化同時(shí)對發(fā)酵過程進(jìn)行控制以提高ga4+7效價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
我國是擁有幾千年歷史的農(nóng)耕大國，在傳統(tǒng)的種植業(yè)中糧食的產(chǎn)量在很大程度上取決于當(dāng)?shù)氐娜照?、溫度、濕度等氣候條件。利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，突破環(huán)境地域的限制，是解決糧食危機(jī)的主要手段。研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞在接受溫度光照等環(huán)境信號(hào)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生低濃度
可調(diào)節(jié)植物生理反應(yīng)的活性物質(zhì)，影響細(xì)胞的分裂、伸長、分化，這些活性物質(zhì)被稱為植物激素。赤霉素是六大植物激素之一，目前已發(fā)現(xiàn)上百種赤霉素同系物，GA4+7和6^最具使用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。GA3因?yàn)榛钚赃^高，副作用很大，GA4+7以其獨(dú)特的優(yōu)勢成為了目前農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。它在植物體內(nèi)的含量非常低，工業(yè)中主要是通過赤霉菌發(fā)酵生產(chǎn)，作為一種新型高效的植物生長激素，主要具有如下特點(diǎn)①破壞休眠。植物在開花前都需要經(jīng)過低溫和長日照，以促進(jìn)GA4+7的合成，打破植物的休眠，外源性的添加GA4+7可以使植物種子提前發(fā)芽。②增加座果，植物的開花期用GA4+7噴灑后可以防止空洞果，增加座果率，能防止在使用其它的生長激素過程中所帶來的營養(yǎng)的浪費(fèi)。③刺激細(xì)胞分裂擴(kuò)大，GA4+7可以抑制細(xì)胞壁過氧化物酶的活性，增加壁的柔韌性，而具有更好伸展性，生長加快，能使細(xì)胞周期縮短30%左右。④誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)，如在諸如葡萄、草莓、杏、梨、番茄等果實(shí)的生長前期，用一定濃度的GA4+7噴灑，可生長得到無籽果實(shí)。GA4+7是不能人工合成的植物激素，其工業(yè)化生產(chǎn)主要是利用赤霉菌發(fā)酵生產(chǎn)。赤霉菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生不同種類的赤霉素，其中以GA3為主，對以產(chǎn)GA4+7為主的菌種報(bào)道極少。GA4+7作為赤霉菌的次級代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)條件與營養(yǎng)組分對其產(chǎn)量影響很大。不同的碳源、氮源、PH及溫度均會(huì)對其產(chǎn)生影響，再加上赤霉菌是強(qiáng)好氧菌，對氧氣的需求量非常高，不同的發(fā)酵條件會(huì)產(chǎn)生不同種類赤霉素，對后期分離提取提出了很高的要求。這嚴(yán)重制約著GA4+7的產(chǎn)量，針對這些問題，若能利用GA4+7產(chǎn)生菌建立一套優(yōu)化的發(fā)酵方法，增加GA4+7效價(jià)，將具有巨大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種赤霉菌；本發(fā)明的另一目的提供一種利用上述赤霉菌發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素ga4+7的方法，在于通過發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及發(fā)酵條件的控制提高GA4+7產(chǎn)量。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種赤霉菌，菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號(hào)是CGMCCNo. 5588，分類命名赤霉菌，菌種的拉丁學(xué)名 Gibberella fujikuroi，參據(jù)的微生物株 NJYHWG32261，保藏日期是 2011. 12. 14。本發(fā)明還提供了一種利用上述赤霉菌發(fā)酵生產(chǎn)GA4+7的方法，其具體步驟為為(I)平板培養(yǎng)將赤霉菌NJYHWG32261菌種接到PDA培養(yǎng)基上，在pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，培養(yǎng)2 4天，得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培養(yǎng)基的組成為(g/L) : 土豆汁150 250、葡萄糖10 30、瓊脂15 20 ;(2)種子培養(yǎng)從PDA培養(yǎng)基上挑1-2個(gè)活化的赤霉菌菌落到裝種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，搖床轉(zhuǎn)速為160 200rpm，培養(yǎng)2 4天，得到種子液；其中種子培養(yǎng)基的裝液量為搖瓶體積的10 20% ;種子培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖30 50、NH4NO3I 2、MgSO4 7H20 0. 8 I. 2、KH2PO4 3H20 0. 5 I. 0 ;(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5% 10%比例接種于裝發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，控制pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，搖床轉(zhuǎn)速為160 200rpm，在發(fā)酵過程的前期增大發(fā)酵液的通氣量，發(fā)酵中后期補(bǔ)加植物油和特征前體，培養(yǎng)6 8天，得到發(fā)酵液；其中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為搖瓶體積的10 20% ;發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L) :30 50的速
效碳源與10 30的遲緩碳源、0. 5 I. 0的氮源、MgSO4 *7H200. 8 I. 2,KH2PO4 *3H200. 5 I. O、NaCl 3 5;優(yōu)選步驟(3)所述的速效碳源為葡萄糖、蔗糖、飴糖或乳糖；遲緩碳源為糊精或淀粉水解液；氮源為(NH4)2S04、NH4N03、NaNO3、花生餅粉、黃豆餅粉或玉米漿。優(yōu)選步驟(3)中發(fā)酵24 28h把搖床轉(zhuǎn)速提高到220 230rpm以提高發(fā)酵液的通氣量；在發(fā)酵72 120h補(bǔ)加植物油，植物油的加入質(zhì)量與發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量體積比為0. I 0. 3g/L ;特征前體的加入質(zhì)量與發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量體積比為0. 2 0. 4g/L ;所述的植物油為豆油或芝麻油；所述的特征前體為氨基乙酸或甲羥戊酸。CGMCC No. 5588菌株具有下述性質(zhì)I、形態(tài)與培養(yǎng)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落圓形，菌絲為白色，稠密的細(xì)絨毛狀，生長旺盛，后期中央菌絲由白色轉(zhuǎn)為黑灰色。有性世代產(chǎn)生子囊孢子，子囊殼呈橢球狀，黑色，大小為lols.sxio^Heym。無性世代產(chǎn)生分生孢子，白色，孢子鐮刀型，有隔膜。赤霉菌菌絲生長和子囊孢子萌發(fā)都要合適條件最適溫度28°C，相對濕度70%，喜偏酸性近中性，PH6.(T7.0,最適 PH6. 8。2、生理生化特性赤霉菌CGMCC No. 5588菌株的主要生理生化特征見表I :表I菌株的生理生化特征
.............................................而............................................................................11................................................................11..................................................................11...................................
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權(quán)利要求
1.一種赤霉菌，菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號(hào)是CGMCC No. 5588，分類命名赤霉菌，菌種的拉丁學(xué)名Gibberellafujikuroi，參據(jù)的微生物株NJYHWG32261，保藏日期是2011. 12. 14。
2.一種利用如權(quán)利要求I所述赤霉菌發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素GA4+7的方法，其具體步驟為 (1)平板培養(yǎng)將赤霉菌NJYHWG32261菌種接到PDA培養(yǎng)基上，在pH6.0 7. 0，溫度為26 32°C，培養(yǎng)2 4天，得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培養(yǎng)基的組成為(g/L):土豆汁150 250、葡萄糖10 30、瓊脂15 20 ; (2)種子培養(yǎng)從PDA培養(yǎng)基上挑1-2個(gè)活化的赤霉菌菌落到裝種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，搖床轉(zhuǎn)速為160 200rpm，培養(yǎng)2 4天，得到種子液；其中種子培養(yǎng)基的裝液量為搖瓶體積的10 20% ;種子培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖30 50、NH4NO3I 2、MgSO4 7H20 0. 8 I. 2、KH2PO4 3H20 0. 5 I. 0 ; (3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5% 10%比例接種于裝發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，控制pH6. 0 7. 0，溫度為26 32°C，搖床轉(zhuǎn)速為160 200rpm，在發(fā)酵過程的前期增大發(fā)酵液的通氣量，發(fā)酵中后期補(bǔ)加植物油和特征前體，培養(yǎng)6 8天，得到發(fā)酵液；其中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為搖瓶體積的10 20% ;發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L) :30 50的速效碳源與 10 30 的遲緩碳源、0. 5 I. 0 的氮源、MgSO4 7H200. 8 I. 2、KH2PO4 3H200. 5 I.O、NaCl 3 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)所述的速效碳源為葡萄糖、蔗糖、飴糖或乳糖；遲緩碳源為糊精或淀粉水解液；氮源為(NH4)2S04、NH4N03、NaN03、花生餅粉、黃豆餅粉或玉米漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中發(fā)酵24 28h把搖床轉(zhuǎn)速提高到220 230rpm以提高發(fā)酵液的通氣量；在發(fā)酵72 120h補(bǔ)加植物油，植物油的加入質(zhì)量與發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量體積比為0. I 0. 3g/L ;特征前體的加入質(zhì)量與發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量體積比為0. 2 0. 4g/L ;其中所述的植物油為豆油或芝麻油；所述的特征前體為氨基乙酸或甲羥戊酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種赤霉菌及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素GA4+7的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。該方法包括平板培養(yǎng)，種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)以及在發(fā)酵培養(yǎng)過程中的條件控制，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加混合碳源，在特定的發(fā)酵時(shí)間補(bǔ)加植物油、添加特征性前體及增加氧通量，而達(dá)到提高GA4+7效價(jià)的目的。本菌株發(fā)酵獲得的GA4+7效價(jià)高，成本低，操作簡便，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102978122SQ201210470269
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者胡永紅, 李佼佼, 楊文革, 錢永根, 唐容容 申請人:南京工業(yè)大學(xué)