專(zhuān)利名稱(chēng)：中慢生根瘤菌kdrm295及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長(zhǎng)的中慢生根瘤菌KDRM295及其應(yīng)用。該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012331，菌株名為中慢生根瘤菌KDRM295。
背景技術(shù)：
自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常溫常壓下，將空氣中的N2還原成NH3。由固氮微生物固定的氮素約占地表化合態(tài)氮的65% - 70%，其中以根瘤菌與豆科植物共生體系固氮能力最強(qiáng)，占生物固氮量的65%以上。利用根瘤菌與豆科植物共生固氮提高土壤肥力和農(nóng)作物產(chǎn)量是世界農(nóng)業(yè)的經(jīng)典經(jīng)驗(yàn)。如用豆科植物作綠肥，讓豆科與非豆科作物輪作、間作和套作。通過(guò)接種根瘤菌提高豆科作物的共生固氮效率和產(chǎn)量及土壤肥力已有100多年歷史，廣泛為各農(nóng)業(yè)大國(guó)所用，是當(dāng)今發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要措施之一。20世紀(jì)80年代以來(lái)，我國(guó)糧食作物的種植面積不斷擴(kuò)大，豆科作物和豆科綠肥的種植面積不斷減少，化肥尤其是氮肥用量不斷增加。由于高水平化合態(tài)氮阻遏根瘤菌結(jié)瘤固氮，接種根瘤菌的結(jié)瘤固氮效應(yīng)在施用大量氮肥的農(nóng)田里急劇下降，根瘤菌接種事業(yè)的發(fā)展隨之被遏制。進(jìn)入21世紀(jì)，中國(guó)實(shí)施西部大開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略和退耕還林還草工程，為擴(kuò)大豆科樹(shù)種、牧草的種植面積和加強(qiáng)與之相匹配的根瘤菌接種技術(shù)應(yīng)用提供了契機(jī)。刺槐(TPoAiflia pseudoacacia L.)又稱(chēng)洋槐,是落葉喬木,高10 - 25米,木質(zhì)堅(jiān)硬，有彈性，抗磨損，是良好礦柱、枕木、建筑用材。刺槐原產(chǎn)美國(guó)東部，引種入歐洲后，于十九世紀(jì)末再?gòu)臍W洲引入中國(guó)。刺槐生長(zhǎng)快，分布越來(lái)越廣，一方面得益于刺槐適應(yīng)性強(qiáng)，能在酸性土、中性土和含鹽量 O. 3%以下的鹽堿土中生長(zhǎng)，有一定的耐旱能力；另一方面刺槐是豆科植物，可以與根瘤菌共生固氮而獲取生長(zhǎng)所必需的氮素，從而適于在貧瘠的土地生長(zhǎng)。種植刺槐的生態(tài)效應(yīng)，如保持水土、改良土壤等，也非常顯著。因此，刺槐成為全世界最重要的速生造林先鋒樹(shù)種之一，也是我國(guó)退耕還林工程的先鋒樹(shù)種。隨著全球石油、煤炭和天然氣等礦物能源的日益枯竭，開(kāi)發(fā)利用可再生的生物質(zhì)能源以取代礦物能源越來(lái)越為世界各國(guó)政府所關(guān)注。目前，中國(guó)經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng)，礦物能源消耗量急劇增長(zhǎng)，能源短缺問(wèn)題十分突出，生物質(zhì)能源等可再生能源的開(kāi)發(fā)和利用已成為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。生物質(zhì)能源的開(kāi)發(fā)和利用的基點(diǎn)在于原料生產(chǎn)，原料成本占總成本的60% - 80%，原料成本決定產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和利潤(rùn)。林木是生物質(zhì)能源的重要原料。刺槐憑借其熱值高，生長(zhǎng)速度快和耐瘠抗逆等特點(diǎn)，成為重要的生物質(zhì)能源樹(shù)種。在貧瘠荒地上，用少施肥、低成本的投入產(chǎn)出高的成材生物量是目前我國(guó)刺槐能源林生產(chǎn)的瓶頸問(wèn)題。用高效結(jié)瘤固氮的根瘤菌接種刺槐苗，通過(guò)共生固氮使樹(shù)苗在貧瘠的土地上獲得氮素成材，可能提高刺槐造林效率和降低原料成本。目前，一方面，在技術(shù)上，現(xiàn)代刺槐造林通過(guò)大規(guī)模苗圃育苗提高造林效率，為刺槐苗人工接種根瘤菌創(chuàng)造了便利條件。另一方面，限于技術(shù)和管理上的制約，我國(guó)的大規(guī)模造林還沒(méi)有向林業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家那樣實(shí)施以氮素為主的大規(guī)模施肥，但不施肥反而為刺槐與根瘤菌的共生固氮?jiǎng)?chuàng)造了沒(méi)有氮阻遏的條件，有利于提高共生固氮的效率。刺槐適應(yīng)貧瘠土壤能力強(qiáng)的一個(gè)因素是它能與多個(gè)屬種的遺傳多樣的根瘤菌共生固氮。已發(fā)現(xiàn)能與刺槐結(jié)瘤的主要是中慢生根瘤菌屬的根瘤菌,還有中華根瘤菌屬(Sinorhizobia )、根瘤菌屬(熱izobium )和慢生根瘤菌屬iBradyrhizobium )等屬的根瘤菌。根瘤菌與刺槐結(jié)瘤固氮的能力高低不一，利用接種根瘤菌促進(jìn)刺槐生長(zhǎng)需要選擇高效的根瘤菌菌株。通常篩選優(yōu)良根瘤菌菌株是通過(guò)從多個(gè)大且飽滿(mǎn)的刺槐根瘤中分離多個(gè)根瘤菌菌株，逐一接種刺槐苗，培養(yǎng)2個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間后，檢測(cè)刺槐苗根部的結(jié)瘤數(shù)和苗的生物量；而要從數(shù)量較多的菌株中篩選出高效結(jié)瘤固氮的根瘤菌菌株要靠碰運(yùn)氣，篩選過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。根瘤菌侵染豆科植物的根會(huì)引發(fā)植物產(chǎn)生植物激素乙烯及合成乙烯的前體1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸(ACC)，而乙烯會(huì)抑制根瘤菌結(jié)瘤和固氮。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)有些根瘤菌有ACC脫氨酶。ACC脫氨酶能催化ACC脫氨基反應(yīng)，生成α-酮丁酸和NH3。根瘤菌侵染根時(shí)，根細(xì)胞合成ACC并釋放部分ACC到細(xì)胞外。有ACC脫氨酶的根瘤菌能吸收并降解植物細(xì)胞釋放的ACC，使根細(xì)胞中的ACC不斷釋放而減少，根細(xì)胞合成乙烯的量就相應(yīng)減少，從而降低了乙 烯對(duì)根瘤菌侵染結(jié)瘤的抑制作用。如果把根瘤菌的ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因CacoSO敲除，根瘤菌的結(jié)瘤能力會(huì)顯著降低(Uchiumi等，Journal ofBacteriology 2004, 186:2439-2448);相反，如果向原本沒(méi)有acoS1的根瘤菌導(dǎo)入acoS1,那根瘤菌工程菌的結(jié)瘤率、占瘤率和固氮效率顯著高于野生型菌株(Ma等，Applied andEnvironmental Microbiology 2004, 70:5891-5897 ;Conforte 等，Journal of Generaland Applied Microbiology 2010, 56:331-338; Tittabutr 等，Systematic and AppliedMicrobiology 2008, 31:141-150; Nascimento Letters in Applied Microbiology2012，55:15-21)。這表明有ACC脫氨酶的根瘤菌有強(qiáng)的侵染力，能高效結(jié)瘤。根瘤菌調(diào)控ACC脫氨酶的機(jī)制比較復(fù)雜。研究已發(fā)現(xiàn)很多有^必的中慢生根瘤菌屬的根瘤菌在自由培養(yǎng)狀態(tài)下不表達(dá)aci/S，沒(méi)有ACC脫氨酶活性，但在根瘤中會(huì)高水平地表達(dá)aci/S，發(fā)揮ACC脫氨酶的作用(Ma 等，Antonie van Leeuwenhoek 2003, 83:285-291 ;Nukui 等，Applied andEnvironmental Microbiology 2006, 72:4964-4969 ;Nascimento 等，F(xiàn)EMS MicrobiologyLetters 2012, 336:26-37)。因此，篩選有ACC脫氨酶的根瘤菌時(shí)，如果檢測(cè)自由培養(yǎng)狀態(tài)下根瘤菌的ACC脫氨酶活性，對(duì)很多根瘤菌尤其是中慢生根瘤菌會(huì)失效，而用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)根瘤菌有無(wú)aci/S基因會(huì)更有效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長(zhǎng)的中慢生根瘤菌KDRM295及其應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的所采用的技術(shù)方案如下
先用常規(guī)方法從刺槐根瘤中分離和純化根瘤菌，再?gòu)母鼍蚪M中擴(kuò)增基因，對(duì)擴(kuò)增出的目標(biāo)片段測(cè)序確定菌株有無(wú)基因和ACC脫氨酶，再用有ACC脫氨酶的根瘤菌菌株接種刺槐幼苗，在接種3個(gè)月后檢測(cè)結(jié)瘤數(shù)、植株的株高、地徑和干重，選出能高效結(jié)瘤、顯著促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng)和提高植株生物量的根瘤菌菌株用于育苗造林。另一方面，擴(kuò)增有ACC脫氨酶根瘤菌的16S rRNA基因并測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析16S rRNA基因序列確定菌株的分類(lèi)歸屬；同時(shí)對(duì)篩選出的有ACC脫氨酶的根瘤菌與同屬根瘤菌中已知有ACC脫氨酶菌株的aci/S基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合菌株16S rRNA基因和ac#基因的系統(tǒng)發(fā)育地位，最終確定得到新的有ACC脫氨酶的根瘤菌株系。本發(fā)明提供的中慢生根瘤菌KDRM295于2012年9月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2012331，保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，分類(lèi)命名為中慢生根瘤菌 KDRM295 ifesorAizoAiw sp. KDRM295。所述的中慢生根瘤菌KDRM295是從在湖北省丹江口市龜山人工種植刺槐的根瘤中分離到的。所述的中慢生根瘤菌KDRM295的細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陰性，在YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成典型的根瘤菌菌落圓形、乳白色、隆起、邊緣整齊不蔓延、表面光滑且因有豐富的胞外多糖而粘稠、較濕潤(rùn)、稍透明；細(xì)胞的生長(zhǎng)需氧，在28°C和中性pH條件下生長(zhǎng)較快，在YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 - 5天形 成菌落的直徑可達(dá)1- 2 _。所述的中慢生根瘤菌KDRM295的16S rRNA基因序列(見(jiàn)SEQ ID NO:1)與中慢生根瘤菌屬典型種百脈根中慢生根瘤菌典型菌株loti ATCC 700743的16SrRNA基因序列一致性為99. 7%,與鷹嘴豆中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia ciceriATCC 51585的16S rRNA基因序列的一致性為99. 4%，與香格里拉中慢生根瘤菌典型菌株Mesorhi zobi um shangri lense CCBAU 65327 的 16S rRNA 基因序列的一致性為 99. 4%,與澳大利亞中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia australicum WSM2073的16S rRNA基因序列的一致性為99. 1%，在系統(tǒng)發(fā)育上與上述四種菌的親緣關(guān)系較近，處在與這四種菌相鄰的一個(gè)分支(圖1)。因此，KDRM295菌株屬于中慢生根瘤菌屬，不能確定屬于哪個(gè)種。所述的中慢生根瘤菌KDRM295有ACC脫氨酶。它的ac必基因部分序列(見(jiàn)SEQID NO: 2)與中慢生根瘤菌屬已知有ACC脫氨酶菌株的ac必序列相似，但差異較大；與駱駝刺中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia alhagi CCNWXJ12-2的acoS1 (GenBank登錄號(hào)AHAMO1000292)的相似度最高，僅為78. 8% ;在系統(tǒng)發(fā)育上的地位也不同于其他中慢生根瘤菌的ac必(圖2)。這表明菌株KDRM295不同于中慢生根瘤菌屬中已知有ACC脫氨酶的菌株。上述中慢生根瘤菌KDRM295的16S rRNA基因和ac必基因的分析結(jié)果結(jié)合表明KDRM295的基因型不同于已知的中慢生根瘤菌。所述中慢生根瘤菌KDRM295能在刺槐根上高效結(jié)瘤固氮，促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng)和成材。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明所述的中慢生根瘤菌KDRM295有ACC脫氨酶，能將ACC分解成α -酮丁酸和NH3,降低植物細(xì)胞合成乙烯的水平，減輕乙烯對(duì)根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌與刺槐的結(jié)瘤率和共生固氮的水平，為刺槐在不施肥的貧瘠荒地上生長(zhǎng)提供高水平的氮素，促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng),增加刺槐成材的生物量,從而用低成本的接種投入讓刺槐成材高產(chǎn),在刺槐育苗造林上發(fā)揮作用。


圖1為中慢生根瘤菌菌株KDRM295 (·)與中慢生根瘤菌屬(ifesorAizoAia )現(xiàn)有25個(gè)種的典型菌株的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖中·指示中慢生根瘤菌屬典型種百脈根中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia loti ATCC 700743, ▲指示鷹嘴豆中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia ciceri ATCC 51585、香格里拉中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia shangri lense CCBAU 65327和澳大利亞中慢生根瘤菌典型菌株Mesorhi zobi um austral icum WSM2073,菌株名后括號(hào)內(nèi)是16S rRNA基因核苷酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)。圖2為中慢生根瘤菌菌株KDRM295 (·)和中慢生根瘤菌屬iMoscxchizobium)中有ACC脫氨酶菌株的a col 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖中■指示駱駝刺中慢生根瘤菌Mesorhi zobi um alhagi CCNWXJ12-2,菌株名后括號(hào)內(nèi)是acoS1基因核昔酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)。
具體實(shí)施例方式1.根瘤菌的分離、純化和保存
從在湖北省丹江口市龜山人工種植的刺槐中選擇健壯刺槐根上大且飽滿(mǎn)的根瘤，用剪刀小心將根瘤連部分根剪下，將同一刺槐根部獲得的5 - 15個(gè)根瘤放入裝有干燥變色硅膠并覆有脫脂棉的小管中。然后將采集的根瘤用無(wú)菌水充分浸泡吸脹后，用95%的酒精浸泡30 S，接著用0.1%的升汞表面滅菌5 min，再用無(wú)菌水沖洗6次，將每個(gè)根瘤編號(hào)后分別放入一個(gè)無(wú)菌的2-ml離心管中，用無(wú)菌的研磨棒將根瘤研碎，用移液器加入I ml無(wú)菌水并吸排3次懸浮勻漿液，將懸浮液系列稀釋10倍，100倍和1000倍，然后分別吸取100 μ I懸浮液涂布在YMA固體培養(yǎng)基(每升含I g酵母粉，10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4, 0.2 gMgSO4, 0.1 g NaCl, l.Og CaCO3, pH 6.8，15 g 瓊脂粉)上，將培養(yǎng)平板放在 28° C 暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3 - 5天后挑取有典型根瘤菌菌落形態(tài)(圓形、乳白色、隆起、邊緣整齊不蔓延、表面光滑且因有豐富的胞外多糖而`粘稠、較濕潤(rùn)、稍透明)的菌落，在YMA平板上劃線培養(yǎng)，重復(fù)3次劃線純化菌落。將純化的單菌落在無(wú)菌水中懸浮，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，選出革蘭氏染色陰性、細(xì)胞呈桿狀且形態(tài)一致的細(xì)菌作為純化的根瘤菌菌株。所述純化的根瘤菌菌株可接種在TY培養(yǎng)液(每升含5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，0.33 g CaCl2, pH 6. 8)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期，與30% (v/v)的甘油溶液等體積混勻，冷凍于_80°C長(zhǎng)期保存。2.根瘤菌ac必基因的擴(kuò)增和鑒定
將根瘤菌菌株接種到TY培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期的100 μ I菌液移至1. 5-ml離心管中，8000 rpm離心5 min,吸去上清液,用0. 5 ml滅菌雙蒸水清洗2次,用100μ I滅菌雙蒸水重新懸浮菌體，取I μ I菌懸液進(jìn)行PCR擴(kuò)增；模板是菌體經(jīng)PCR預(yù)變性反應(yīng)加熱裂解后釋放的 DNA ;引物是 acdSf3 :5’-ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC-3’和 acdSr3 5’-GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT-3’，使用濃度為0. 4 μ M0反應(yīng)體系用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的2XTaq PCR MasterMix0 PCR擴(kuò)增在Bio-Rad S1000型PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4 min;94°C變性45 s，53°C退火45 s，72°C延伸I min,35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后送至英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司用引物acdSf3和acdSr3進(jìn)行測(cè)序。
從菌株KDRM295擴(kuò)增得到的DNA片段在去除引物后的序列見(jiàn)SEQ ID NO: 2。將序列SEQ ID NO: 2在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索，結(jié)果顯示SEQ ID NO: 2與中慢生根瘤菌屬根瘤菌的ac必相似，其中相似度最高的是駱駝刺中慢生根瘤菌典型菌株Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2 的 acdS (GenBank 登錄號(hào) AHAMO1000292)，二者間的一致性為78. 8%。這表明擴(kuò)增得到的序列是ac必序列，菌株KDRM295有ACC脫氨酶。3.用有ACC脫氨酶的根瘤菌接種刺槐苗和檢測(cè)接種效應(yīng)
選直徑約O. 8 -1 cm的刺槐根，剪成8 - 10 cm的根段，將根段插入苗床的育苗基質(zhì)中，在25 - 28° C，相對(duì)濕度75 - 85%的溫室中培養(yǎng)，每周澆水一次，在約5周后刺槐出苗約5 - 8 cm時(shí)進(jìn)行接種。具體為先將有ACC脫氨酶的根瘤菌在YMA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的新鮮菌落接種至TY培養(yǎng)液中，在28° C和200 rpm培養(yǎng)48 - 72 h至穩(wěn)定期；培養(yǎng)時(shí)每個(gè)500-ml錐形瓶裝100 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)后每毫升約含5 X IO9個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。然后將菌液用自來(lái)水稀釋500倍后澆灌苗床。對(duì)照幼苗用等量的自來(lái)水代替進(jìn)行澆灌。接種3個(gè)月后檢測(cè)刺槐苗的結(jié)·瘤數(shù)、株高、地徑和干重。其中菌株KDRM295的結(jié)果如表I所示。表I根瘤菌KDRM295接種刺槐苗的效應(yīng)
權(quán)利要求
1.中慢生根瘤菌KDRM295，其特征在于它已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO M 2012331。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中慢生根瘤菌KDRM295在刺槐育苗造林中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長(zhǎng)的中慢生根瘤菌KDRM295及其應(yīng)用。該中慢生根瘤菌KDRM295菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM2012331。本發(fā)明所述的中慢生根瘤菌KDRM295有ACC脫氨酶，能將ACC分解成α-酮丁酸和NH3，降低植物細(xì)胞合成乙烯的水平，減輕乙烯對(duì)根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌與刺槐的結(jié)瘤率和共生固氮的水平，為刺槐在不施肥的貧瘠荒地上生長(zhǎng)提供高水平的氮素，促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng)，增加刺槐成材的生物量，從而用低成本的接種投入讓刺槐成材高產(chǎn)，在刺槐育苗造林上發(fā)揮作用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103045500SQ201210475049
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者李江川, 李萬(wàn)里, 張繼泰, 劉震東, 吳奇志 申請(qǐng)人:中盈長(zhǎng)江國(guó)際新能源投資有限公司