一種豬脂肪代謝相關(guān)基因islr及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬脂肪代謝相關(guān)基因ISLR及其應(yīng)用。所述豬脂肪代謝相關(guān)基因ISLR為SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且具有同等功能的由SEQ?IDNO.1衍生的核苷酸序列。本發(fā)明首次利用基因芯片篩選到受鹽酸克倫特洛刺激引發(fā)表達(dá)上調(diào)的EST序列，該基因在豬脂肪代謝中具有調(diào)節(jié)作用，為研究豬脂肪代謝及發(fā)育提供了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】—種豬脂肪代謝相關(guān)基因ISLR及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種豬脂肪代謝相關(guān)基因ISLR及其應(yīng)用。【背景技術(shù)】
[0002]Immunoglobulin Superfamily Containing Leucine-Rich Repeat (ISLR,富含亮氨酸重復(fù)序列的免疫球蛋白樣蛋白)是1997年由Nagasawa等人從人類視網(wǎng)膜扣除文庫(kù)中研究分析得到的一種新蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員。這個(gè)新蛋白包含兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)區(qū)域LRR和Tg樣區(qū)域。LRR是一個(gè)重復(fù)的結(jié)構(gòu)單元，由幾個(gè)重復(fù)拷貝的氨基酸序列組成。推測(cè)包含此結(jié)構(gòu)的蛋白在蛋白質(zhì)互作和細(xì)胞粘附方面起著重要作用。這些蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)甚至多個(gè)LRR結(jié)構(gòu)單元伴隨N末端或者C末端獨(dú)特的序列。Ig超家族是一組包含一個(gè)甚至多個(gè)保守Ig樣區(qū)域的蛋白質(zhì)家族。盡管這類蛋白的功能多樣，所有這類的蛋白均涉及和其它蛋白的粘附互作或存在于細(xì)胞表面。已知報(bào)道的同時(shí)含有LRR結(jié)構(gòu)域和Ig區(qū)域的蛋白很少，ISLR蛋白的功能有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。
[0003]多年來(lái)人類肥胖和動(dòng)物體脂的過(guò)度沉積是國(guó)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。我國(guó)是世界上最大的養(yǎng)豬生產(chǎn)國(guó)，然而我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)在發(fā)展過(guò)程中還存在著嚴(yán)重的不足，比如缺乏自己的優(yōu)良品種，生豬質(zhì)量(即遺傳素質(zhì)、包括出欄率、屠宰豬的平均瘦肉率、存欄豬平均胴體重等)不聞，以及料肉比遠(yuǎn)聞?dòng)陴B(yǎng)豬發(fā)達(dá)國(guó)家。關(guān)于豬的生長(zhǎng)和肉質(zhì)形狀的研究一直是熱點(diǎn)問(wèn)題。我國(guó)地方豬品種沉積脂肪的能力極強(qiáng)，屠宰豬的平均瘦肉率只有50%多，這大大影響了豬的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。藥物鹽酸克倫特羅是一種β 2腎上腺素受體激動(dòng)劑，俗稱“瘦肉精”。大量研究表明克倫特羅能增強(qiáng)脂肪分解和抑制脂肪沉積，提高畜禽生長(zhǎng)速度，降低料肉比。然而它在生物體內(nèi)殘留時(shí)間長(zhǎng)，毒性大，可能對(duì)消費(fèi)畜禽產(chǎn)品的人造成二次污染。傳統(tǒng)的雜交技術(shù)可以帶來(lái)豬肉質(zhì)性狀方面一定的改良，但進(jìn)展緩慢，難以滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的物質(zhì)需求。因此迫切需要一種新的方法或毒副作用小的藥物來(lái)取代克倫特羅在提高胴體瘦肉率方面的作用。
[0004]EST是cDNA克隆兩端的cDNA部分序列，一般較短。由于EST測(cè)序只測(cè)定基因的部分序列，也不需要對(duì)克隆排序，因而具有經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)。在通過(guò)mRNA差異顯示、代表性差異分析等方法獲得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全長(zhǎng)cDNA序列，以便對(duì)該基因的功能進(jìn)行研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種豬脂肪代謝相關(guān)基因ISLR，或與SEQID N0.1所示的核苷酸編碼相同蛋白的核苷酸序列。 [0006]本發(fā)明另一目的在于提供含有上述基因的載體。
[0007]本發(fā)明又一目的在于提供含有上述基因或載體的宿主細(xì)胞。
[0008]本發(fā)明再一目的在于提供上述基因在調(diào)節(jié)豬脂肪發(fā)育及代謝中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明利用基因芯片對(duì)飼喂藥物鹽酸克倫特羅的香豬脂肪組織進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，得到一些差異表達(dá)基因，其表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs)序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (NCBI)中比對(duì)不到同源序列，得到了本發(fā)明的豬脂肪代謝相關(guān)基因ISLR，并在豬個(gè)體水平上進(jìn)行驗(yàn)證。[0010]本發(fā)明的豬脂肪代謝相關(guān)基因ISLR的核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示，該基因 cDNA全長(zhǎng)2443bp，編碼區(qū)為1287bp，編碼428個(gè)氨基酸，與人和鼠的同源關(guān)系高達(dá)86%以上，與人更為相近。[0011]此外，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞等。[0012]具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明對(duì)藥物鹽酸克倫特羅飼喂和不飼喂的芳香豬的脂肪組織進(jìn)行 cDNA芯片雜交，有45條差異表達(dá)的ESTs，比對(duì)NCBI，其中9條比對(duì)不到任何同源序列，屬于豬的中未知序列也未知功能的基因。電子延伸差異表達(dá)的EST (rpig-3584)，比對(duì)到人的 Islr基因。并且提取RNA進(jìn)行RT-PCR的技術(shù)路線，得到它的完整編碼序列。再利用5’RACE 和3’ RACE獲得全長(zhǎng)的2443bp的cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，與人的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)它與人類基因ISLR具有高度同源性。[0013]利用熒光定量PCR檢測(cè)rpig_3584在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的香豬脂肪組織中的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)rpig_3584在實(shí)驗(yàn)組中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，且差異顯著。[0014]根據(jù)上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果為：[0015]本發(fā)明首次利用基因芯片篩選到受鹽酸克倫特洛刺激引發(fā)表達(dá)上調(diào)的EST序列， 利用該序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)定量PCR擴(kuò)增得到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組豬體內(nèi)ISLR基因的表達(dá)水平，從而確定該基因在豬脂肪代謝中的作用。這是ISLR功能鑒定及分析的基本技術(shù)，包括對(duì)該基因表達(dá)部位、表達(dá)時(shí)間、表達(dá)水平多個(gè)方面的檢測(cè)；同時(shí)也包括了在對(duì)該基因進(jìn)行人為干預(yù)，如過(guò)表達(dá)或siRNA干擾后，對(duì)脂肪發(fā)育及代謝影響的重要指標(biāo)的鑒定評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】[0016]圖1為ISLR在鹽酸克倫特羅處理前后的脂肪組織中表達(dá)檢測(cè)結(jié)果；P1、P3分別表示在三月齡的非CLB處理及CLB處理豬只，P2、P4分別表示 在四月齡的非CLB處理及CLB 處理豬只?！揪唧w實(shí)施方式】[0017]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。[0018]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。[0019]實(shí)施例1 ISLR基因的分子克隆[0020]1、對(duì)藥物鹽酸克倫特羅飼喂和不飼喂的芳香豬的脂肪組織進(jìn)行cDNA芯片雜交， 有45條差異表達(dá)的ESTs，比對(duì)NCBI，其中9條比對(duì)不到任何同源序列，屬于豬的中未知序列也未知功能的基因。差異表達(dá)的EST (rpig-3584)的核苷酸序列如下：[0021 ] CCCGGGCTGCAGGAATTCGGCACGAGTTTGGCCGGAAGGAGGGAGTTTACGGGCTGCCTGGGCTCCCTT CCTGCAGCCTCCTCTCTGCAGACCTTCTCAGGCACCCTGTCCCGGGACGAAAAGGGCACCCAGGCTTGCAG (下劃線標(biāo)注部分為EST序列在cDNA中的存在部分)。[0022]2、電子延伸差異表達(dá)的EST (rpig-3584)，獲得具有完整開(kāi)放閱讀框的延伸序列， 并比對(duì)到人的Islr基因。依據(jù)延伸序列設(shè)計(jì)特異性引物。上下游引物分別為：[0023]上游引物：5’-TGTTGITITGGGTTCCGTCT-3’ ；[0024]下游引物：5’ -GATGCATACCTGGAGGGAAA-3，。[0025]3、利用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)芳香豬脂肪組織提取RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得豬 ISLR基因的目的條帶。將回收得到的ISLR基因的PCR產(chǎn)物與pGM-T連接，采用天根生化科技(北京）有限公司的PGM-T克隆試劑盒克隆目的片段，連接產(chǎn)物采用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自天根生化科技有限公司），并篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)上海生物工程有限公司測(cè)序，所測(cè)序列與預(yù)期結(jié)果一致。ISLR基因0RF序列見(jiàn)SEQ ID NO. 1 (長(zhǎng)1287bp)。[0026]4、以豬ISLR基因0RF序列為基礎(chǔ)，利用5’ RACE和3’ RACE獲得全長(zhǎng)的2443bp的 cDNA序列，[0027]5’ RACE 引物：5’ -ACGGAACCCAAAACAACAAA-3’[0028]3，RACE 引物：5，-ATGAGGTGATGCCCTAACCA-3’[0029]獲得的豬ISLR基因全長(zhǎng)cDNA序列的核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示。[0030]實(shí)施例2 ISLR基因在豬脂肪組織中的功能分析[0031]1、將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的香豬脂肪組織差異表達(dá)的EST序列進(jìn)行RNA提取，同時(shí)也再次驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組為藥物鹽酸克倫特羅飼喂的3月齡豬只（P3)及4月齡豬只（P4)，對(duì)照組為不飼喂的3月齡豬只（P1)及4月齡豬只（P2)，使用天根生化科技(北京） 有限公司的RNA提取試劑盒提取。[0032]2、反轉(zhuǎn)錄 RNA[0033]1)在PCR管中依次加入[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種豬脂肪代謝相關(guān)基因ISLR，其為：1)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；2)該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且具有同等功能的由SEQID NO. 1衍生的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求2所述基因的載體。
3.含有權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2所述載體的宿主細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述基因在調(diào)節(jié)豬脂肪發(fā)育及代謝中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103834662SQ201210480125
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月22日
【發(fā)明者】孟慶勇, 高婧, 劉秋月, 張闊, 任立明, 胡曉湘, 李寧 申請(qǐng)人:孟慶勇